PloS ONE：RNA-Seq技术的优缺点

RNA-Seq可进行全基因组水平的基因表达差异研究，具有定量更准确、可重复性更高、检测范围更广、分析更可靠等特点。除了分析基因表达水平，RNA-Seq还能发现新的转录本、SNP、剪接变体，并提供等位基因特异的基因表达。对于RNA-Seq的优缺点，Helicos BioSciences的研究人员在《PloS ONE》上做了清晰阐述。

　　

一直以来，研究人员都很有兴趣了解细胞在各种不同状态下的基因表达差异，并开发出多种方法，来不断提高灵敏度和增加通量。基因表达芯片是近年来较多采用的方法，但它如今却碰上了一个强劲对手——RNA-Seq。

RNA-Seq可进行全基因组水平的基因表达差异研究，具有定量更准确、可重复性更高、检测范围更广、分析更可靠等特点。除了分析基因表达水平，RNA-Seq还能发现新的转录本、SNP、剪接变体，并提供等位基因特异的基因表达。

RNA-Seq的动态范围更广，且假阳性可能更小，这意味着RNA-Seq的数据重复性应当比芯片要高。RNA-Seq能够检测样品中的所有RNA，这对于鉴定细胞的新颖转录本来说是个优点，但同时缺点在于，它检测了总的RNA，而细胞中很大一部分RNA都来自核糖体和线粒体。这限制了其他RNA的读取数量以及这些RNA表达水平的准确性。因此，polyA RNA选择和核糖体RNA去除等方法被开发出来，以便解决这个问题。

然而，这些分离方法有可能会引入潜在误差，影响实验结果。因此，第三代测序公司Helicos BioSciences的研究人员对操作方法修改后可能发生哪些差异进行了研究，文章发表在最近一期的《PloS ONE》上。

他们认为，对于研究人员来说，必须了解以下几点：技术差异如何影响结果的质量和可解释性，操作方法如何引入潜在误差，RNA的来源如何影响转录检测，以及所有这些差异如何影响得到的结论。

Helicos BioSciences公司的研究人员使用了多个人RNA样品，来评估RNA片段化、RNA分离、cDNA合成，单个以及多个标签计算。尽管采用polyA RNA选择的操作方法得到了最多的非核糖体读取，并能够最精确测定编码转录本，但研究人员发现这种方法只能检测人细胞中的一部分非核糖体RNA。

polyA RNA排除了数千个注释的转录本以及更多未注释的转录本，使得转录组查看不完全。而核糖体去除的RNA则提供了一个更经济的方法，来生成完整的转录组覆盖。与多个标签相比，利用单个标签的表达测定具有评估基因表达和检测短RNA的优势。

这项工作有望帮助研究人员在分析基因表达时选择适当的产品。（生物通 薄荷）

原文摘要：
Raz T, Kapranov P, Lipson D, Letovsky S, Milos PM, et al. (2011) Protocol Dependence of Sequencing-Based Gene Expression Measurements. PLoS ONE 6(5): e19287. doi:10.1371/journal.pone.0019287

摘要：
RNA Seq provides unparalleled levels of information about the transcriptome including precise expression levels over a wide dynamic range. It is essential to understand how technical variation impacts the quality and interpretability of results, how potential errors could be introduced by the protocol, how the source of RNA affects transcript detection, and how all of these variations can impact the conclusions drawn. Multiple human RNA samples were used to assess RNA fragmentation, RNA fractionation, cDNA synthesis, and single versus multiple tag counting. Though protocols employing polyA RNA selection generate the highest number of non-ribosomal reads and the most precise measurements for coding transcripts, such protocols were found to detect only a fraction of the non-ribosomal RNA in human cells. PolyA RNA excludes thousands of annotated and even more unannotated transcripts, resulting in an incomplete view of the transcriptome. Ribosomal-depleted RNA provides a more cost-effective method for generating complete transcriptome coverage. Expression measurements using single tag counting provided advantages for assessing gene expression and for detecting short RNAs relative to multi-read protocols. Detection of short RNAs was also hampered by RNA fragmentation. Thus, this work will help researchers choose from among a range of options when analyzing gene expression, each with its own advantages and disadvantages.