如何解决技术难题 且看五个科学实例

　　

生物通报道：随着对细胞生理研究的逐渐深入，科学家们开始解析单个细胞的行为，这是因为即使是同样的遗传物质，同样的周边环境，这些细胞还是会朝着不同的方向发展，有时还会生成不同的功能，而且单个细胞的变化还关系到癌症，神经疾病等疾病。

然而要分析单个细胞，却不是那么容易的事情，在基因表达分析中占据主要位置的DNA芯片这种分析方法，由于灵敏度不够，所以不足以发现单个细胞水平上的差异，但是从单个细胞中挑选少量RNAs，或者蛋白也不容易做到，而且如果还要分析细胞的动力学因素，那就不只是繁琐实验的问题，还需要物理学，机械学，和生物学的多方配合。为了解决这些问题，五位科学家分别采用了不同的方法，为研究人员提供了新思路。

如何观察单细胞在复杂信号系统中的应答

来自斯坦福大学的单分子研究专家Stephen Quake研究组在单分子实验中也遇到了相同的问题，他们希望能检测相同细胞对于相同信号的反应，之前研究人员已经利用定量PCR进行了批量分析，但是他们还是希望能就单个细胞如何对不同浓度的信号分子TNF-α产生相应的响应进行分析。

细胞信号交流调控着基本的细胞活性以及人体中相应的细胞活动。细胞准确应答周围环境的能力是发育、组织修复和免疫的基础。深入理解细胞间的相互交流将有助于了解生物系统的复杂性，或能开发出癌症，糖尿病及其他自身免疫疾病的新疗法。

因此Quake研究组研发了一种新方法来观察单一细胞在细胞信号复杂系统中的应答反应，这种方法就是高通量的微流体细胞培养(high-throughput microfluidic cell culture)，将这一技术与荧光显微镜，定量基因表达分析和建立数学模型等研究手段结合起来，Quake研究组首次发现相同细胞之间存在大范围的差异，并且指出了科学家的一些认识可能已经被基于细胞群体研究的结果所误导。

细胞活化这一结果是一样的，然而细胞达到结果的过程可能是不一样的，群体研究不能显示信息错综复杂的信号网络中的差异，而这在单一细胞水平中可以观察到。

研究人员利用不同的蛋白浓缩物刺激细胞，这些浓缩物是免疫系统应答炎症或癌症反应的代表性物质。结果发现，一些细胞接受信号并被激活，而一些细胞则没有激活。研究人员人员观察到细胞以不同的方式产生应答，但是细胞的基本反应在许多方面是一致的。

这种方法的优势是效率十分高——利用这种方法，研究人员能同时处理成百上千的细胞，并且观察长达4天的时间里，这些细胞的反应。而缺点就是微流体实验并不容易操作，因此一定要考虑清楚。如果你希望观测细胞对于一个信号刺激的反应，那么也许一个96孔板就能搞定，但是如果你希望了解细胞在系列环境中的反应，那么微流体实验也许更加合适，具体来说还得看个人的情况。

如何分析单细胞不同时间基因表达的细微差别

来自加州大学欧文分校H. Kumar Wickramasinghe教授研究组希望能验证基因异常表达，会导致干细胞变成癌症干细胞这一理论，因此需要分析单个细胞生命周期中不同时间点内，基因表达的细微差别。

在这项研究中，Wickramasinghe教授采用了一种新方法来处理mRNA，这种方法主要借助于一种十分精巧，称为介电纳米探针（dielectrophoretic nanoprobes，生物通译）的探针，这种探针表面带有特异性mRNA的引物。当这种探针的针尖（20nm）通过细胞膜的时候，就会产生一个电场，吸引细胞核内的分子，这样探针收回来的时候，研究人员就能计算这一mRNA选择性“钓”到的分子，比如在Wickramasinghe教授这一实验中，就是癌基因表达相关的分子。

Wickramasinghe教授认为这种方法中细胞不会死亡，从而研究人员之后还能向其注入试剂，让这一基因沉默，一个星期之后又能实时观察细胞的具体变化了。

这一方法的优点就是相对于其它基因组分析方法，这一方法不会破坏细胞，能进行进一步分析，而且实验过程时间短——整个过程大约只需要几分钟。缺点就在于这些细胞必需是自然贴壁的，如果像成纤维细胞那样，就要增加一步步骤进行处理。不过Wickramasinghe教授提出也许可以在浸泡在一种细胞外基质的组织培养物中对细胞进行处理。

如何提高检测灵敏度

来自维吉尼亚州大学，伊利诺斯大学的研究人员在单细胞动力学研究方面就遇到了这种问题：细胞在移动过程（包括相互黏连，或者到细胞外基质中去）中需要借助分子力前进或者后退，研究人员希望能分析单个细胞中的这种机械力。

维吉尼亚州大学的Martin Schwartz教授研究组为此发明了一种传感器，这种生物传感器能在活体中测量蛋白所承受力，研究人员利用这一传感器发现了粘着斑蛋白承受力的奥秘。

细胞对物理力量做出响应的能力对于发育和生理来说都是根本性的，包括血液、细胞粘附和迁移的调控。难以对活体细胞中的分子力进行测量的难度限制了对此现象的研究。

新开发的这种传感器就是一种基因编码的荧光张力感应模块，该模块能够在活体中测量穿过特定蛋白的机械力。研究人员利用这种传感器对粘着斑蛋白进行了测试——粘着斑蛋白是一种膜-细胞骨架蛋白，它被吸引到粘着斑上，并将细胞粘附分子（整合素）与肌动蛋白细丝相连。结果他们发现粘着斑蛋白承受力的能力决定粘着斑在力的作用下是整合还是分解。

这种新型生物传感器应能应用于力传导中所涉及的其它蛋白，主要优点就是能精确的分析涉及的机械力，而且灵敏度高，比一般方法的灵敏度至少高100倍，也能用于检测细胞膜表面变形情况。缺点就是蛋白接触传感器会改变蛋白的功能，因此研究人员需要花费较多的时候尝试。

如何简单快捷观测磷酸化蛋白

来自东京大学干细胞生物学与再生医学研究室Hiromitsu Nakauchi教授希望能了解干细胞增殖和重编程过程中的分子级联信号，因此他分析了造血干细胞中蛋白磷酸化造成的影响。

在这项研究中，Nakauchi教授采用了一种简单的免疫染色技术：单细胞磷酸成像分析（single-cell imaging of phosphorylation assay，SCIPhos）。首先将大约50个细胞想排列在载玻片上，然后进行染色，通过共聚焦显微镜进行观察，通过这些染色了的磷酸化修饰蛋白，Nakauchi教授可以了解哪些蛋白处于活性状态，哪些蛋白失活了，以及这些蛋白的位置。Nakauchi教授说，“我的一些学生也利用这个方法来做Western Blotting”。

这种SCIPhos方法的优点就是不仅仅能观察磷酸化蛋白，而且能分析蛋白的位置，这有利于揭示关键的生物信息。缺点就是每个细胞需要单个成像，如果需要处理上千个细胞，那就是一个繁重的实验了。因此这个方法比较合适分析少量的细胞，其中的小技巧就是要多注意防止水分蒸发，Nakauchi教授就是采用的在细胞液滴的周围，用阻水笔（water-repellent pen）绕着画一圈，这样液滴就不会干燥得太快。

如何实时观测RNA运动

来自爱因斯坦医学院的细胞生物学教授Robert Singer希望能了解mRNAs通过细胞核核孔中进入细胞质的具体过程，但是传统的显微技术并不能实时追踪到这个过程，因此Singer教授想出了一个新方法，观察活细胞中RNA的运动情况。

首先Singer教授用黄色荧光蛋白标记mRNA分子，用红色荧光蛋白标记核孔，通过高速摄像机将mRNA分子通过核孔的过程拍摄下来，从而揭示了mRNA分子如何通过核孔从细胞核进入细胞质的动态机制。这是研究人员第一次在活细胞中实时观察分子的膜孔转运。这项研究也发现了与之前认知不同的结果：mRNA迅速地通过了核孔，缓慢地停泊在细胞核的边缘等待释放进入细胞质，具体而言是单个mRNA分子在到达核孔后会等待80毫秒，然后在5毫秒的时间内快速通过核孔，最后分子在核孔的另一边又等待80毫秒然后才被释放到细胞质。

在此之前，显微镜的分辨率仅为200nm，这意味着活细胞中小于这一范围的分子无法被分辨。而通过这项新技术，研究人员将显微镜的分辨率提高了10倍，成功地区分了大小仅为20nm的分子。

这一方法的优点是测量精度提到了纳米级，缺点是这种成像方法中用到的两个相机拍摄必须完全对齐，这并不是个简单的工作。

（生物通：万纹）