Illumina全面而强大的基因表达分析方案[选购宝典]

Illumina不仅在测序技术上领先，还凭借多个创新灵活的产品来引领遗传分析行业。它的RNA表达谱分析能够在Illumina基于BeadArray™技术的系统上开展，而更多聚焦特定目标的定制研究可用VeraCode®技术在BeadXpress® 平台上开展（图1）。因此可对广泛的样本类型实现全面基因覆盖。

图1：基因表达谱分析和验证的选择

具体地说，Illumina的直接杂交全基因组表达分析（Direct Hybridization Whole-Genome Expression assays）可用于分析完整的RNA样本，而它的DASL®assays（cDNA介导的退火、选择、延伸和连接分析）则能够实现对困难或降解的RNA样本的分析，比如甲醛固定石蜡包埋（FFPE）的组织。这些经过验证的分析可提供非常准确的数据，简化的流程，以及适合高通量多重基因表达谱分析的多个样本形式。

这些分析中的任一个所产生的数据均可用Illumina的GenomeStudio® 数据分析软件来查看和分析。GenomeStudio软件中性能优化的工具和用户友好的图形化界面让研究人员能够快速轻松地将数据转化成有意义的结果。

Illumina的表达阵列

Illumina的全基因组基因表达芯片（Whole-Genome Gene Expression BeadChip）包含了固定在微珠表面上的寡核苷酸，这些微珠置于阵列基质表面的微孔中（图2）。每个阵列上高水平的微珠类型冗余（每个探针平均有多达30个微珠）也部分支持了数据的质量和重复性。在将微珠随机分布在基质表面之后，每个微珠上存在的29-mer地址序列（address sequences）在杂交步骤中用于在阵列中的定位，以确定每个微珠的位置。这最后的一步同时也是验证每块BeadChip芯片上每个微珠的杂交表现，确保100%的阵列质量控制。

图2：Direct Hyb基因表达谱的微珠设计

Illumina的Expression BeadChip阵列是以多样本形式排布的，在增加通量的同时降低了样本之间的差异性。标记的样本cRNA通过与BeadChip芯片上50聚探针的杂交而被检测出来。清洗和染色步骤之后，在HiScan™ SQ、iScan或BeadArray™ Reader上扫描BeadChip芯片。若想实现最高的样本通量（每次多达216个阵列），研究人员可使用AutoLoader、AutoLoader 2或AutoLoader 2.×，将BeadChip芯片的上样和扫描自动化。

全面的阵列内容
Illumina Expression BeadChip芯片上每个探针的位置（地址）和序列组合都经过生物信息学法则的仔细挑选。利用一种多步骤算法来设计基因特异的探针，以便优化一些参数，包括：
• 与其它基因没有相似性
• 不存在 基因组中的高度重复序列
• 序列复杂度
• 自身互补性，以预测发夹结构
• 熔解温度，以实现杂交均一性
• 与转录本3’端的距离

Illumina的表达阵列方案包含了适合人、小鼠和大鼠全基因组表达应用的完整试剂盒，并特有精选自广泛使用的数据库的最新内容，例如美国国立生物技术信息中心参考序列（NCBI RefSeq1）及更专业的来源。

杰出的性能
Illumina已经对所有Expression BeadChip芯片的性能数据进行收集。通过技术性重复（平行重复实验）之间的高度一致性证明了产品的重复性。灵敏度、动态范围、倍数变化检测精确度上的杰出性能参数让差异表达分析的影响最大化。

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直接杂交分析

直接杂交全基因组表达分析（Direct Hybridization Whole-Gene Expression assay）可为全基因组基因表达提供最高的多重分析能力，能够同时对超过47,000个转录本进行图谱分析。通过将最新的基因组内容与低成本、高通量的阵列处理相结合，Illumina的Expression BeadChip芯片可高效而且经济地为各种规模的基因表达分析提供高质量数据。它们是差异表达分析、疾病分类、通路分析和表达数量性状位点（eQTL）研究等应用的理想选择。

人HumanHT-12 表达芯片
全新的HumanHT-12 v4.0 Expression BeadChip芯片以最新的内容和行业领先的定价支持高效的人全基因组基因表达谱研究。它的高价值内容为已深入了解的基因、候选基因及剪接变体提供了基因组范围的转录覆盖，且相当一部分靶定了同行评议的文献所支持的确认序列。

这种BeadChip芯片的每个阵列都靶定了31,000多个注释基因，包含了47,000多个探针。探针设计覆盖NCBI RefSeq 第38次发布（2009年11月7日）以及UniGene的内容。

12个样本的形式方便于大规模基因表达应用。有了HumanHT-12 BeadChip芯片，表达信息能轻松地并入基于Infinium® 分析的全基因组关联研究（GWAS）或甲基化研究中。

小鼠MouseWG-6和MouseRef-8 表达芯片
MouseWG-6 v2.0和MouseRef-8 v2.0 Expression BeadChip芯片是Illumina为以小鼠作为模式生物的研究人员提供的全基因组基因表达谱分析方案。MouseRef-8 BeadChip芯片特有来自NCBI RefSeq数据库的最新内容。除了RefSeq的内容，MouseWG-6 BeadChip芯片还补充了靶定MEEBO（Mouse Exonic Evidence Based Oligonucleotide）数据组的探针2，以及RIKEN FANTOM24-6数据库中所描述的典型蛋白编码序列3-5。

研究人员能够在单个BeadChip芯片上对6个（MouseWG-6）到8个（MouseRef-8）样本进行图谱分析，显著提高了通量，同时也降低了实验之间的差异性。Illumina对每个探针的100%杂交质量控制确保了小鼠表达 BeadChip芯片具有行业最佳的性能和重复性。

大鼠RatRef-12 表达芯片
RatRef-12 Expression BeadChip芯片可让研究人员在单个BeadChip芯片上平行产生12个样本的全基因组表达谱，具有杰出的性能和超强的通量。BeadChip芯片内容（每个阵列上22,523个探针）主要是从NCBI RefSeq数据库中挑选而来的。低样本输入量、和高质量数据及100% 质量控制等特征让RatRef-12 Expression BeadChip芯片成为以大鼠作为模式生物的研究人员当下最全面的方案。

人类全基因组 DASL分析

Human Whole-Genome DASL （cDNA介导的退火、选择、延伸和连接）assay是唯一一个能从低丰度或部分降解的人RNA样本中产生全基因组表达图谱的优化整合系统，特别适用于那些来自甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织的RNA样本。它简化了发现过程，让研究人员从存档样本中产生表达谱，从而鉴定出新的生物标志物，并将那些图谱与已知的临床结果相关联。

一些供应商用于分析FFPE样本的竞争方法往往基于一些经过甚少验证的流程，通常既昂贵，又不可靠。Illumina的全基因组 DASL assay克服了这些限制，通过将两种久经考验的分析方法进行创新组合，可实现对全基因组的高灵敏度表达谱分析。

这个分析方法将Illumina久经考验的DASL分析中的独特PCR和标记步骤与Illumina的直接杂交分析中的全基因组探针组相结合（图3）。这大大增加了DASL分析的目标组，包含了NCBI RefSeq（RefSeq Build 36.2，Release 22）中已深入了解的基因，同时保留了准确分析部分降解的RNA样本的能力。

Whole-Genome DASL Assay为同时分析24,000多个转录本提供了一个高度多重且低成本的阵列方案。只需来自新鲜冷冻组织的10-100 ng总RNA或者来自FFPE组织的50-200 ng总RNA，就能产生高度可重复的表达谱（r2 > 0.97）。

图3：用Whole-Genome DASL Assay进行的RNA图谱分析

VeraCode DASL Asssy

对于聚焦特定目标的验证研究，DASL Asssy可用VeraCode技术在BeadXpress平台上开展。VeraCode上的DASL Asssy可实现分析准确性和高样本通量的最佳组合，为宝贵FFPE样本的低至中度多重表达谱分析提供了可自定制的解决方案。

VeraCode的突破性设计在于圆柱形的玻璃微珠的使用。每个微珠都内嵌一个独特的全息代码，表面则连接了某一个基因特异的寡核苷酸探针的多个拷贝。在探针杂交之后，样本在BeadXpress Reader上扫描。这个高通量的双色激光系统同时检测分析荧光基团，并根据全息代码确定探针身份，可实现快速准确的信号检测。大的微珠表面积，再加上液相的分析试剂，显著改善了杂交动力学，实现了更快的通量，并让试剂费用最小化。

定制分析可轻松地设计为靶定特异的转录本。Illumina的科学家和专利的分析设计工具（Assay Design Tool，简称ADT）能够帮助客户创建成功的内容组合。可利用序列、登录号或基因符号的形式提交个性化的内容设计请求。VeraCode DASL分析可实现灵活的定制内容组合设计，一次可对32-384个转录本进行图谱分析。

表达阵列的数据分析

Illumina 的表达芯片属于完整的基因表达方案的一部分，这个方案包括仪器、软件和试剂盒。数据分析是简单的，因为已知的生物学相关转录本在管理良好的数据库中有注释，而探针是由Illumina科学家设计和验证的。
Illumina的GenomeStudio 基因表达模块能够实现对样本、群、群组及所有相关项目分析的简化数据管理。它提供了探针水平和基因水平的统计分析工具，用于差异分析、热图显示和聚类。

总结

Illumina基于BeadArray的技术可实现对人、小鼠和大鼠的高性价比的表达谱分析方案。多重样本的BeadChip芯片提高了通量，支持简化的实验。这些BeadChip芯片含有来自多个重要数据库来源的最新、全面的内容。DASL分析可支持FFPE或有限RNA样本的表达谱分析，目前有BeadArray平台上的全基因组基因表达BeadChip芯片或者VeraCode平台上的定制的目标聚焦组合可供选择。无论哪一种实验设计，Illumina的产品均可提供一条最快最经济的捷径，通向发现和文章发表。