P[acman]技术：新型研究工具

来自贝勒大学医学院的研究人员建立了一种特定的称为P[acman]的工具建立文库的克隆，这个库涵盖了果蝇的绝大部分基因组，这个技术将为遗传学研究加速。这一研究成果公布在《Nature Methods》杂志上。

　　

生物通报道：来自贝勒大学医学院，美国劳伦斯伯克力国家实验室（Lawrence Berkeley National Laboratory，LBNL）等处的研究人员利用一种新型的称为P[acman]的工具建立了文库克隆，这个库涵盖了果蝇的绝大部分基因组，这个技术将为遗传学研究加速。这一研究成果公布在《Nature Methods》杂志上。

领导这一研究的是贝勒大学医学院分子和人类遗传学教授Dr. Hugo Bellen，这位科学家从事果蝇研究多年，在分子遗传学和蛋白研究方面获得了许多重要的成果。

P[acman]技术实际上是Hugo Bellen博士2006年发明的一种技术方法，这是一种将DNA插入果蝇基因组的新方法，一种真正意义上实现研究果蝇全基因组结构和功能的方法，这一方法也可用于其它模式生物，如小鼠的研究中。当年的相关文章发表在Science杂志上。

Hugo Bellen博士认为这一方法克服了现在通用方法的关键障碍，能够在活体条件下研究大片段DNA，而且这种新技术使研究人员能够在果蝇中研究大片段基因和基因综合体（gene complexes），这在以前是不可能实现的。

在最新的文章中，Hugo Bellen博士领导其研究组的研究人员利用P[acman]技术来分析活果蝇中的大部分的DNA，这个载体系统能操纵的P/phiC31人工染色体，而且联合了多种不同的技术：能够保持细菌DNA大片段的细菌人工染色体，能够操纵细菌DNA大片段的重组技术，利用phiC31介导的转基因技术将基因组DNA插入到果蝇基因组的特定位点。

P/phiC31人工染色体（artificial chromosome），或称P(acman)，结合了三种最新技术：细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome ，BAC，能够使大片段DNA维持在细菌中）、重组技术（recombineering）、能将大片段DNA插入果蝇基因组特定位点的phiC31-介导的转基因技术（phiC31-mediated transgenesis）（见下图）。

这是一项意义深远的新技术。P(acman)越过了阻碍研究的绊脚石，能够将克隆得到的大片段DNA用于基因组转化，并且保证DNA片段插入基因组特异位点。目前研究基因机构和功能的技术都存在这样那样的问题，比如研究人员培育缺少特定基因的果蝇时，如果想将这种特定基因重新放入基因组中，那么插入位点经常是没有规律的。

细菌人工染色体（BAC）是一种遗传特性稳定，不易发生缺失和重组的技术方法，能帮助科学家将大片段DNA维持在细菌中，但是只有一个或少数几个拷贝。当然细菌在必要时会产生许多DNA拷贝。在这一方法技术上，科学家们添加了重组（recombineering）技术。利用重组技术能够很方便地克隆出大片段DNA，并且可以在基因中的任意位点造成特异突变。除此之外，phiC31-mediated transgenesis则能够帮助研究人员在果蝇基因组中寻找有潜力的突变基因，而且这种方法在小鼠和人类细胞中也可以发挥功能，提示这种新技术具有通用性。

研究人员利用P[acman]技术建立了一个基因组库，从而可以在包含所需基因的基因库中选择自己所需要的基因和发现有回应的克隆。他们在劳伦斯伯克力国家实验室（Lawrence Berkeley National Laboratory）的合作者Roger Hoskins和Joseph Carlson博士在基因库的绘制、构建和注释方面做出了重大的贡献。

研究人员表示，这样就可以插入一个基因的单一副本和挽救一个突变体，或者是对基因进行结构和功能的分析，如果不知道基因是在哪里表达的，就可以标靶它，将它放回，然后对它表达的位点进行定位。

另外一方面，phiC31也是一种重要的催化重组酶，研究人员曾利用基因工程技术重组蚊子的基因，成功地培育了几种携带有phiC31靶序列的新品种蚊子。研究人员利用催化重组酶，能够将几种不同的基因植入到蚊子DNA的相同位点，并可以重复这种操作，这大大增加了这种研究方法的可靠性。

phiC31方法能够将DNA片段植入到宿主细胞DNA的“伪位点”（与真位点相似度仅有30％）。尽管整合过程的效率较低，但科学家们还发现很多动物的染色体至少有一个伪位点。利用这一点，研究人员将phiC31方法用于基因治疗，比如凝血因子IX基因与血友病关系密切，研究人员利用催化重组酶的方法，在肝脏内的凝血介质中加入凝血因子IX，很多实验小鼠的肝脏细胞很快就能够生产出大量的凝血因子IX，其数量足以治疗血友病症状。

phiC31插入DNA链条的整合位点主要有两个，人体染色体组则要复杂得多，研究人员目前已经在人体染色体组中确认了19个主要的整合位点，如果能开发出新的催化重组酶，将实现更为精确的位点植入。

（生物通：万纹）

原文摘要：

Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster

We constructed Drosophila melanogaster bacterial artificial chromosome libraries with 21-kilobase and 83-kilobase inserts in the P[acman] system. We mapped clones representing 12-fold coverage and encompassing more than 95% of annotated genes onto the reference genome. These clones can be integrated into predetermined attP sites in the genome using C31 integrase to rescue mutations. They can be modified through recombineering, for example, to incorporate protein tags and assess expression patterns.