单细胞转录组测序技术鉴定出发育中的基因表达变化

　　

Life Technologies公司和剑桥大学Gurdon癌症与发育生物学研究所的研究人员合作开发出一种单细胞转录组测序技术，用于研究细胞从内细胞团发育成胚胎干细胞时的基因表达变化。

这种技术不仅可用于研究正常发育时单细胞水平发生的变化，也适用于研究疾病状态如癌症和神经退行性疾病的变化，它发表在近期的《细胞•干细胞》杂志上。Life Technologies正将这种技术开发成一个试剂盒。

研究人员以去年一项发表在《自然方法学》上的研究为基础，该研究在胚胎中采用了单分子RNA测序方法。Life Technologies分子生物学部门的首席科学家，文章的通讯作者Kaiqin Lao告诉《In Sequence》，在那项研究中的细胞大约比干细胞多50倍，而在目前这项研究中，作者们在只含有100 飞克（1飞克 = 10^-15克）mRNA的细胞上验证了这种方法同样可行。

Lao及他的研究小组在Life Technologies的SOLiD仪器上对不同发育阶段的33个单细胞的转录组进行了测序，以便研究当细胞从小鼠胚泡的内细胞团发育成多能胚胎干细胞时的基因表达变化。

研究人员首先确认了只有来自内细胞团的细胞包含有可发育成胚胎干细胞所必需的基因。然后，他们分析了在细胞发育成胚胎干细胞过程中五个不同阶段的单个细胞。他们的目标是研究细胞发育时基因表达如何改变，并找出同一发育阶段不同细胞之间的基因表达差异。

剑桥大学的研究人员利用Life Technologies开发的引物来捕获mRNA，并将其转化成cDNA，随后扩增。然后Life Technologies的研究人员以此开展测序。

Life Technologies的研究小组从每个细胞中获得了三千万-四千万个读数，Lao认为这足够研究中的分析使用。“如果你想要查看剪接变体，那么两千万个读取就太低了。四千万个是你的目标。”

在他们测序的胚胎干细胞阶段的12个细胞中，他们检测到大约65%的已知转录本，Lao认为这很有可能是发育早期阶段的基因表达程度。

Lao表示，他正在努力改进这种方法，公司将开发一个试剂盒，用于“低起始量”的转录组测序，但目前还没有上市日期。

首先，Life Technologies的研究小组必须优化操作步骤，以便能够捕获每个转录本的全长。目前，用于分离mRNA的引物偏向转录本的3’端，因此对于长转录本来说缺少5’端。在这个特定研究中，这并不是问题，但对于想研究转录起始位点的研究人员来说，方法必须改进。

Lao表示，他们能够捕获最多3 kb的转录本，或者说转录本的60%。他正在使用不同的酶和试剂，努力将长度扩大至10 kb。他认为这将是这项技术有待克服的最大技术障碍。“扩大至10 kb需要一切都准确无误，”他这样表示。

他表示倾向于让这种方法成为链特异的，并利用一个带有条形码的96孔板来实现，这样来自96个不同细胞的RNA就能一次收集并测序。Lao认为那两个改进都不太难，目前已经有一种方案让方法成为链特异的，不过未在本次研究中使用。

利用这种技术，研究人员可以展示当细胞发育时基因表达是如何改变的。他们还鉴别出两类看起来负责调控多能性的microRNA，以及似乎在调控发育中起作用的选择性剪接事件。

作者们将胚胎干细胞的转录组与来自内细胞团和外胚层细胞的转录组进行了比较。他们发现了细胞处于不同阶段时在分子特征上的清晰差异。具体地说，他们发现2475个基因在内细胞团阶段和胚胎干细胞阶段的表达存在4倍以上的变化，另外大约2362个基因存在0.25倍以下的变化。此外，他们还发现了2110个基因在外胚层和干细胞阶段存在4倍以上的变化，而1170个基因存在0.25倍以下的变化。

比较同一阶段不同细胞之间的表达水平，他们发现中等表达水平的基因比高表达水平的基因有着更高的可变性。

冷泉港实验室的博士后研究人员Nick Navin认为这个结果彰显了单细胞转录组测序的力量，他曾使用单细胞全基因组测序来研究肿瘤异质性(IS 5/18/2010)。他认为：“他们清晰表明在某一特定阶段，细胞与细胞之间多个基因的表达往往不同。如果他们一直在研究细胞群体，那么有着不同表达水平的稀有细胞将会错过。”

研究人员还发现，在胚胎干细胞阶段，与细胞命运相关联的基因已经变得丰富。“这表明已经有一些分化。一些细胞已经开始走向它们的谱系。”Navin这样说。

他还谈到了一个特别有趣的发现，就是作者们发现当ICM细胞发育时表达的转录本异构体存在很大变化，包括胚胎干细胞中缺失的128个转录变异体，以及169个在ICM中不表达而在ESC中表达的转录本。

Gurdon研究所生理学与生殖方面的教授，文章的另一位通讯作者Azim Surani通过电子邮件告诉《In Sequence》，研究结果提示“在胚胎发育的过程中，对选择性剪接的调控可能对建立和调控单个细胞中的转录网络至关重要。”

最后，作者们鉴定出两类miRNA，一类促进分化，而另一类抑制分化。Surani表示，两组miRNA可能共同作用，从而维持多能状态。他说“这两组miRNA也许可以让胚胎干细胞对不同的信号分子和培养条件作出正确的响应。”

他表示，他的研究小组目前正在使用单分子RNA测序来研究早期生殖细胞发育过程中的基因表达动力学，以帮助了解表观遗传的重编程事件。他认为这种技术对分析细胞群体中的细胞异质性很有用，这个群体包括中枢神经系统、造血和其它干细胞，以及肿瘤细胞。它在鉴定癌症干细胞的存在时特别有用。

Navin也同意这种技术在研究癌症时特别有用，因为肿瘤的异质性。他说：“将它与全基因组结构变化相结合，将是了解肿瘤亚群的一种非常强大的方法。”

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