Nature Methods：新型蛋白标记技术

　　

生物通报道：未知基因组及蛋白质序列数据库有限的物种的蛋白质组学分析是当前一些非模式生物物种蛋白质组学研究领域的瓶颈之一，一般研究人员会通过同源性搜索的BLAST方法来鉴定未知基因组的蛋白质，但是这种方法也存在一定的可行性和可靠性的问题，因此发展出一种新方法来确定对未知生物的基因组开展研究具有重要的意义。

来自德国马普研究院的研究人员利用一种新型的蛋白标记技术在新生东方蝾螈（Newt）尾巴中发现了3000多种蛋白，这种动物是一种可以在四肢甚至内脏器官损伤之后重新再生的动物，因此它们是研究再生现象非常合适的动物模型。但是由于东方蝾螈的基因组非常复杂而且尚未进行完全测序，并且它的基因组要比人体基因组大10倍之多，因此似乎很难对东方蝾螈进行高通量的蛋白质组学研究。

研究人员采用的这种方法是一种常用于对不同培养环境下细胞蛋白质组进行比较分析的标记技术，通常进行蛋白质组学研究的方法都是先将蛋白质组酶解成一个个的小肽段，然后运用质谱分析技术确定这些肽段的序列，最终通过与数据库数据进行比对的方法判断出原始蛋白质的序列。如果对某个物种的基因序列和蛋白质序列都了解得非常清楚时上述这种研究策略还是非常可行的，但是如果进行跨物种的物种间比对，那么就很容易得到错误的结论。

在最新的这项研究中，研究人员采用的是一种称为细胞培养氨基酸稳定同位素标记（Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture，SILAC），这种方法首先是由2002年丹麦Mann实验室的Ong等对AACT技术作了进一步改进而获得的，他们首次应用于定量蛋白质组研究，为全面、系统地定性和定量分析复杂哺乳动物细胞蛋白质组提供了有效的方案。

SILAC的基本原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经5-6个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定。

研究人员通过在细胞培养时加入稳定的同位素标记的氨基酸，用这种方法进行双重的蛋白质序列分析，从而可以跟踪蛋白质的转归或者对不同培养条件下蛋白质的表达情况进行比较。

蛋白质组学是大规模研究细胞蛋白质的方法，主要使用质谱技术。通过质谱技术，科学家们已经研制出许多测量生物样品中蛋白质数量的方法，而SILAC方法就是其中之一，使用SILAC，生物样品中的蛋白质被含有“重同位素”的氨基酸所标记，这种被标记的蛋白质在质谱仪中被去除，因此可与未标记的样品进行比较。

在这篇文章中，研究人员利用这种SILAC技术对未标记的东方蝾螈和标记的东方蝾螈进行了研究，用这种方法来寻找能够与建立的东方蝾螈表达序列标签文库以及斑马鱼文库、青蛙文库、蝾螈（salamander）文库、人类文库和小鼠文库当中的序列相匹配的蛋白质。当研究人员在普通培养条件和同位素培养条件下都发现了同一蛋白质时，他们就认为这个结果是可信的。通过这种同位素标记技术，研究人员就能够对再生的东方蝾螈尾部蛋白质组和正常未受伤的东方蝾螈尾部蛋白质组进行比对。

不过这种方法需要非常精确的量化分析，因此只适用于能够完全被重氨基酸所代谢标记的组织或细胞。另外一篇Nature Methods文章中，研究人员对SILAC方法进行了改进，使之能够测出人类原发性肿瘤中的蛋白质数量，而这种肿瘤本身不能被代谢标识。包括肿瘤在内的人类组织是由许多种类的细胞组成，它们能在不同水平上表达蛋白质。为了代表取自特定肿瘤中的许多不同类型的细胞和蛋白质，研究小组用重氨基酸标识了含有不同永生人类癌症细胞系的混合物。采用这种超级SILAC方法，他们精确测出人类肿瘤组织中的蛋白质数量，包括乳腺癌和脑癌组织。除了可用于肿瘤生物学以外，超级SILAC方法还可应用于蛋白质生物标识的发现，以检测早期癌症。

SILAC方法已被广泛应用于微生物和体外培养细胞的蛋白组学研究，并且已经有了一些市场产品，比如赛默飞世儿就推出了干细胞和乳腺癌研究的SILAC工具，其中包括

• 用于SILAC的小鼠干细胞扩增DMEM，低渗透压小鼠干细胞DMEM和人间充质干细胞通用的扩增培养基。它们是专门设计用于干细胞增殖和SILAC蛋白表达图谱的质谱分析。
• 干细胞筛选过的透析FBS，确保不会促进干细胞分化。
• 小鼠胚胎干细胞的血清替代物，利于检测分泌蛋白。
• 用于SILAC的无酚红MEM培养基，适用于易受雌激素刺激的细胞，如乳腺癌细胞系MCF7，而不会产生人为的雌激素反应。

上述产品能与Thermo Scientific HyClone的AdvanceSTEM系列干细胞产品共同使用，为研究人员提供了干细胞培养的整体解决方案。除了这些癌症和干细胞蛋白定量的培养基，赛默飞世尔还单独提供了同位素标记的氨基酸，有13C6, 15N2标记的L-赖氨酸和13C6标记的L-精氨酸。有了这些氨基酸，你能进行多重SILAC分析。例如，在正常的精氨酸和赖氨酸，精氨酸（+10）和赖氨酸（+6），或精氨酸（+6）和赖氨酸（+8）中培养细胞，并同时比较三种处理方法。此外，赛默飞世尔还提供了L-脯氨酸作为培养基添加剂，以防止同位素标记的精氨酸代谢转换成脯氨酸。

另外Invitrogen也有相关的稳定同位素标记氨基酸细胞培养试剂盒，这些SILAC标记的主要优点是体内标记技术，稳定同位素标记的氨基酸与天然氨基酸化学性质基本相同，对细胞无毒性，因而它所标记的细胞和未标记细胞在生物学行为上几乎没有差异，标记效率可高达100%，另外这种标记活体标记，更接近样品真实状态，不过这种方法也存在一定的缺点，比如只适用于活体培养的细胞对于生物医学研究中常用的组织样品，体液样品等无法分析等。

（生物通：万纹）

原文摘要：
monya baker. (2010) Proteomics for exotic organisms Nature Methods,7(4):260.
Looso, M. et al. Advanced identification of proteins in uncharacterized proteomes by pulsed in vivo SILAC. Mol. Cell. Proteomics advance online publication (5 February 2010).