让我们看得更清楚！细胞生物学家发现成像新技术

　　

生物通报道：几个世纪以来，科学家们都是利用光学显微镜对肉眼无法看到的结构进行观测，目前光学显微镜已经成为了实验室必备的实验器材之一，但是随着研究的深入，光学显微镜的分辨率已经无法达到科学家们的要求了。

来自国立卫生研究院的细胞生物学家Jennifer Lippincott-Schwartz研究组进行的一系列研究让显微镜的分辨率提高了数个等级，使得研究者可以从纳米级观测细胞突起的伸展。而她在Nature Methods上发表的系列文章更是证明了这种技术的真实实力。

Lippincott-Schwartz研究组采用的是一种称为光激活定位显微技术(photoactivated localization microscopy, PALM) ，他们的这种新产品能将荧光显微镜的分辨率提升至纳米级水平。

荧光显微镜的基本原理是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。

由于荧光光源——般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。因此荧光显微镜具有检出能力高，对细胞刺激肖，能进行多重染色等优点。

2008年《Nature Methods》把年度技术颁给了超分辨率荧光显微镜，这是对荧光显微镜的一种肯定，Lippincott-Schwartz研究组开发的的PMLM正是超分辨率荧光显微镜中的佼佼者，这种纳米显微镜（nanoscopy）通过电子束的扫描或者其他方式在CCD上成像，具有高分辨率，快速检测，使用简便等特点。

Lippincott-Schwartz研究组的研究人员利用PALM来成像溶酶体和线粒体薄的部分、被固定的完整细胞中特定的靶标蛋白。许多罕见的光活化荧光蛋白分子亚群被活化、定位（2到25纳米），然后被漂白。这些来自所有亚群的聚集位置信息然后被组合成一种极高分辨率的图像。

通过利用PALM，研究人员溶酶体和线粒体薄的部分、被固定的完整细胞中特定的靶标蛋白进行成像。他们获得了focal adhesions的vinculin、一个切片中的机动蛋白和质膜上的逆转录病毒蛋白Gag的分布情况。

这种PALM的基本原理是用PA-GFP来标记蛋白质，通过调节405 nm激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用488 nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子，在确定这些分子的位置后，再长时间使用488 nm激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激活出来。

这之后，分别用405 nm和488 nm激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环，这个循环持续上百次后，将得到细胞内所有荧光分子的精确定位，将这些分子的图像合成到一张图上最后得到了一种比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微技术。

近年来，高分辨率荧光显微镜获得了长足的发展，比如哈佛大学霍华德休斯医学研究所的华裔女科学家庄小威也一直在研究如何用光敏开关探针来实现单分子发光技术。他们希望能用光敏开关将原本重叠在一起的几个分子图像暂时分开，这样就能获得单分子图像，从而提高分辨率。

其研究组也在Nature Methods杂志上发表，命名为一种随机光学重建显微镜（stochastic optical reconstruction microscopy, STORM）。使用STORM可以以20nm的分辨率看到DNA分子和DNA-蛋白质复合体分子。这一方法基于光子可控开关的荧光探针和质心定位原理，在双激光激发下荧光探针随机发光，通过分子定位和分子位置重叠重构形成超高分辨率的图像，其空间分辨率目前可达20nm。STORM虽然可以提供更高的空间分辨率，但成像时间往往需要几分钟，同时还不能满足活体实时可视的成像的需要，发展空间很大。

之后Lippincott-Schwartz的研究团队将PALM技术和单颗粒示踪技术（single-particle tracking）结合，成功地观测到活体细胞胞膜蛋白的运动情况。

同时庄小威研究组也在在Science杂志上也发表了他们的3D STORM成像成果，该技术的空间分辨率比以往所有光学3D成像技术的分辨率都要高出10倍。研究人员展示了用3D STORM成像技术拍摄的肾细胞内微管结构图和其它的分子结构图。随后，他们又进一步将该技术发展成了多色3D成像技术（multicolor 3D imaging）。

这些技术的发展其实还处于起始阶段，相信在未来，我们还将看到更多的技术进步，正如Lippincott-Schwartz所说的那样，尽管这项技术还存在其缺点，但是在细胞生物学的很多领域，如细胞结构研究或分子不均匀性研究，纳米显微技术肯定占有自己的一席空间。

(生物通：万纹)

附：

远场超分辨发展简史

1992年，Stefan Hell在OC上发表文章，第一次展示4Pi显微镜
1994年，Stefan Hell在OL上发表STED理论。
1997年，Neil在OL提出SIM。
2000年，Mats Gustafsson研究了机构化照明显微镜（structured-illumination microscopy, or SIM），在Hela 细胞肌动蛋白细胞骨架成像中，在横向分辨率方面进行了双重改进。
2006年，庄小威，利用单分子发射源成像，在《nature method》发表了随机光重建显微镜（stochastic optical reconstruction microscopy ，STORM），并使用它以20纳米的分辨率观测DNA 和DNA蛋白质复合体
2006年，Samuel Hess，利用单分子发射源成像，在《Biophysical Journal》，发表荧光激活定位显微镜技术，简称(fluorescence photoactivation localization microscopy, FPALM)
2006年，Lippincott-Schwartz，Betzig， 和 Harald Hess在《science》上发表了他们的PALM方法，使用它里给细胞黏着斑和特定细胞器的蛋白质成像。
2007年，Harald Hess小组证实FPALM可以用来检测脂质筏中聚集的蛋白。
2008年，Lippincott-Schwartz的小组把PALM和单粒子失踪结合起来探测肝细胞膜蛋白的运动。
2008年，Zhuang的小组展示了 3D STORM成像，比三维空间衍射极限空间分辨率好十倍，并使用此方法在猴肾细胞中成像微管和其他分子结构，后来扩展此方法为整个细胞的多色3D成像。
2008年，Gustafsson和其他报告使用3D SIM—一种使用三束干扰光线代替二束的方法—来观测哺乳动物细胞核无法被共聚焦显微镜探测的部分。
2008年，Hell的小组在nature杂志报道使用 STED方法视频展示活神经元里突触泡的活动，与标记抗体有关的蛋白质。后来，他们把4Pi和STED结合起来产生了固定细胞线粒体的3D影像，以40— 50纳米的分辨率。

原文摘要：

Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches.
Mitra K, Lippincott-Schwartz J.

National Institute of Child Health and Human Development, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

Mitochondria are organelles that have been primarily known as the powerhouse of the cell. However, recent advances in the field have revealed that mitochondria are also involved in many other cellular activities like lipid modifications, redox balance, calcium balance, and even controlled cell death. These multifunctional organelles are motile and highly dynamic in shapes and forms; the dynamism is brought about by the mitochondria's ability to undergo fission and fusion with each other. Therefore, it is very important to be able to image mitochondrial shape changes to relate to the variety of cellular functions these organelles have to accomplish. The protocols described here will enable researchers to perform steady-state and time-lapse imaging of mitochondria in live cells by using confocal microscopy. High-resolution three-dimensional imaging of mitochondria will not only be helpful in understanding mitochondrial structure in detail but it also could be used to analyze their structural relationships with other organelles in the cell. FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) studies can be performed to understand mitochondrial dynamics or dynamics of any mitochondrial molecule within the organelle. The microirradiation assay can be performed to study functional continuity between mitochondria. A protocol for measuring mitochondrial potential has also been included in this unit. In conclusion, the protocols described here will aid the understanding of mitochondrial structure-function relationship.


New roles for endosomes: from vesicular carriers to multi-purpose platforms

The careful sorting and recycling of membranes and cargo and the intracellular delivery of proteins, toxins and viruses by endocytosis are well-established roles for the endocytic apparatus, which is present in all eukaryotic cells. Recently, it has become clear that endosomes have key roles in such diverse processes as cytokinesis, polarization and migration, in which their functions might be distinct from those classically associated with endosomes. We speculate that endosomes function as multifunctional platforms on which unique sets of molecular machines are assembled to suit different cellular roles.