设计一个成功的IHC/ICC实验（FAQ）[心得点评]

【字体：大中小】 时间：2010年06月08日 来源：R&D Systems

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　　R& D Systems位于细胞生物学行业领先地位，2009年NATURE系列刊物就有790篇论文使用R&D Systems的产品。高质量的IHC抗体不仅提供低背景高信号的染色结果，而且可以反映组织生理学的真实结果。R& D Systems抗体交叉反应低，特异性高，保证了真实可靠的信号结果。

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1. R&D Systems一抗的质量如何？
为保障实验结果的可靠性，使用低交叉反应的高品质抗体。R&D抗体主要采用活性重组蛋白作为免疫原，而不是人工合成的多肽。IHC/ICC抗体经过实验多重筛选及不同组织测试，避免了由于抗体的品质问题而导致的科研人员时间与样本的浪费，保证了真实可靠的信号结果。

2. R&D Systems一抗IHC应用区分石蜡和冰冻切片吗？区分IHC和ICC吗？
R& D Systems抗体经过不同的细胞及组织材料的筛选，能特异性识别石蜡和冰冻切片中的抗原，IHC和ICC相互通用。

3.做IHC/ICC, 选择单抗还是多抗？
单抗和多抗的固有特性决定了其优劣势。单抗，由单个B细胞克隆产生的，具有高亲和力和针对单个抗原表位的特异性。如需检测具有相同氨基酸序列的蛋白家族，单抗就非常适合。单抗和抗原结合的效果取决于抗原能否保持其天然构象。但是抗原的构象一旦由于各种原因发生改变，如由于蛋白相互作用，翻译后修饰，温度，pH，固定，盐浓度等，单抗和抗原结合的效果会受到严重影响。

由于多抗可以识别多个表位，不太受蛋白质构象变化的影响。一般来说，在一定的pH值和盐浓度范围内，多抗也比单抗更加稳定。基于这些原因，多抗比单抗更适合IHC/ICC实验。与其他公司多抗不同，R& D Systems有一类经抗原亲和纯化的多抗（货号以AF开头），该多抗通过抗原亲和柱的纯化提高了特异性，更加适合IHC/ICC实验。

4.一抗试剂的孵育条件？一抗浓度，温度，时间？
一抗抗体浓度，稀释，孵育时间和温度都会影响染色质量。这些变量需要针对不同抗体和样品进行优化，以达到高特异性，低背景的信号。一般的优化过程是，保持固定的孵育时间和温度，同时改变抗体的浓度以决定最佳的低噪音背景的信号。例如，使用一只高亲特异性抗体，可以使用相对较高的抗体浓度配套较短的孵育时间；或者，相对较低的抗体浓度配套较长的孵育时间。为促进特异性染色，常选用较长的孵育时间及较低温度下进行（如室温和4°C）。
R＆D Systems的染色优化方案: 对于组织切片，起始优化条件是4°C孵育过夜; 对于染色细胞，起始优化条件是室温孵育1小时。经抗原亲和纯化的多抗 (1.7-15 ug/mL) 较单抗(5-25 ug/mL)的工作液浓度低。如使用不同浓度的同一抗体比较样本的染色效果，孵育时间和温度一定要一致。在实验室中使用新抗体时，建议进行预实验测试教广的抗体浓度。

一抗孵育的起始优化条件

样本	抗体
样本	单抗	多抗
组织	5-25 ug/mL，4°C孵育过夜	1.7-15 ug/mL，4°C孵育过夜
细胞	5-25 ug/mL，室温孵育1小时	1.7-15 ug/mL，室温孵育1小时
优势	单抗原表位特异性	工作浓度低
劣势	易受抗原表位的变化影响	非特异性高，需经过抗原亲和纯化