复旦大学BMC Genomics文章结合两种重要技术

　　

生物通报道：来自复旦大学上海医学院，附属华山医院等处的研究人员将激光捕获显微切割技术与生物芯片技术联合起来，有效地检测在肿瘤细胞中特异表达的microRNA。这一研究成果公布在2010年第11期的《BMC Genomics》杂志上。

文章的通讯作者是复旦大学上海医学院朱虹光教授，其早年毕业于上海第一医学院，现任复旦大学上海医学院病理学系教授、博士生导师；中华医学会上海分会病理专业委员会委员、肝病专业委员会委员。主要从事肿瘤标志物，肿瘤分子病理和肝病病理方面的科研工作，并负责复旦大学附属华山医院外科病理的诊断工作。

人体组织由细胞和细胞间基质组成，肿瘤也不例外。除了肿瘤细胞之外，肿瘤还含有血管、结缔组织等基质。目前，常规对肿瘤样品基因表达量的研究实际上是对肿瘤细胞和基质混合物的研究。基质细胞往往没有癌变，因此对肿瘤细胞和基质混合物进行研究往往会掩盖掉肿瘤细胞中并不是很明显的基因表达异常。

在这篇文章中，研究人员利用激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection，LCM）很好的解决了这一难题。相关成果发表在2010年第11期的《BMC基因组学》（BMC Genomics）上。激光捕获显微切割技术是在显微镜下从组织切片中高选择性地分离、纯化单一类型细胞群或单个细胞的新技术。LCM技术与microRNA芯片技术相互结合能有效地检测在肿瘤细胞中特异表达的microRNA。为了保障实验结果的可靠性，研究人员选用了灵敏度与重复性俱佳的Agilent microRNA芯片。

研究人员首先用LCM技术分离出61例不同个体结肠组织中的上皮细胞（24例正常组织，13例腺瘤，24例癌组织），提取total RNA，用Agilent microRNA芯片分析microRNA的表达情况。然后分析相同组织microRNA表达情况的相关系数，结果显示正常组织的相关系数为0.942，腺瘤组织的相关系数为0.963，癌组织的相关系数为0.937。随后针对同一肿瘤样品，做了3次重复实验（LCM分离上皮细胞，提取total RNA，Agilent microRNA芯片实验），分析3次重复实验的相关系数为0.999。上述实验从生物学重复和技术重复两个方面验证了LCM+Agilent microRNA芯片实验的稳定性

随后，研究人员开始研究同一肿瘤组织中肿瘤细胞与基质细胞之间的基因表达差异。用LCM技术分别分离3种组织（正常组织、腺瘤、癌）的上皮细胞和基质细胞，用Agilent microRNA芯片分别检测这3种组织不同细胞中的microRNA表达情况。结果显示在同一肿瘤组织中，上皮细胞与基质细胞之间，仍有51个差异表达的microRNA。

另外，单独就上皮细胞而言，腺瘤、癌与正常组织在microRNA表达方面存在差异，而对于基质和整个肿瘤组织而言，腺瘤与正常组织之间并没有显著差异。这一结果表明腺瘤与正常组织上皮细胞之间的差异被掩盖掉了。而用LCM技术分离组织切片中的特定细胞群进行研究则能很好的解决这一问题，提高特异性与灵敏度。

最后研究人员用定量RT-PCR对LCM+Agilent microRNA芯片实验的结果进行验证，结果表明两者的相关系数为0.996。这表明LCM+Agilent microRNA芯片实验不仅能提高对肿瘤组织检验的灵敏性，而且也有很好的稳定性。在科研、临床检验方面有巨大的应用前景。

原文摘要：

Improvement of tissue preparation for laser capture microdissection: application for cell type-specific miRNA expression profiling in colorectal tumors.

BACKGROUND: Laser capture microdissection (LCM) has successfully isolated pure cell populations from tissue sections and the combination of LCM with standard genomic and proteomic methods has revolutionized molecular analysis of complex tissue. However, the quantity and quality of material recovered after LCM is often still limited for analysis by using whole genomic and proteomic approaches. To procure high quality and quantity of RNA after LCM, we optimized the procedures on tissue preparations and applied the approach for cell type-specific miRNA expression profiling in colorectal tumors. RESULTS: We found that the ethanol fixation of tissue sections for 2 hours had the maximum improvement of RNA quality (1.8 fold, p = 0.0014) and quantity (1.5 fold, p = 0.066). Overall, the quality (RNA integrity number, RIN) for the microdissected colorectal tissues was 5.2 +/- 1.5 (average +/- SD) for normal (n = 43), 5.7 +/- 1.1 for adenomas (n = 14) and 7.2 +/- 1.2 for carcinomas (n = 44). We then compared miRNA expression profiles of 18 colorectal tissues (6 normal, 6 adenomas and 6 carcinomas) between LCM selected epithelial cells versus stromal cells using Agilent miRNA microarrays. We identified 51 differentially expressed miRNAs (p <= 0.001) between these two cell types. We found that the miRNAs in the epithelial cells could differentiate adenomas from normal and carcinomas. However, the miRNAs in the stromal and mixed cells could not separate adenomas from normal tissues. Finally, we applied quantitative RT-PCR to cross-verify the expression patterns of 7 different miRNAs using 8 LCM-selected epithelial cells and found the excellent correlation of the fold changes between the two platforms (R = 0.996). CONCLUSIONS: Our study demonstrates the feasibility and potential power of discovering cell type-specific miRNA biomarkers in complex tissue using combination of LCM with genome-wide miRNA analysis.

作者简介：

朱虹光，男，1955年生，复旦大学上海医学院病理学系教授、博士研究生导师。1983年毕业于上海第一医学院医学专业本科，获学士学位；本科毕业后考入上海第一医学院病理学专业师从应越英教授攻读硕士及博士学位，1986年毕业于上海医科大学研究生院病理学专业，获硕士学位；1990年毕业于上海医科大学研究生院病理学专业，获博士学位。1991年9月获德国著名奖学金-Max-Planck奖学金赴德国的世界著名研究所马克斯―普朗克协会( Friedrich-Miescher-Laboratorium, Max-Planck-Gesellschaft ) 进行博士后研究三年，主攻肿瘤细胞及分子免疫学。于1994年6月回国后，历任上海医科大学基础医学院病理学教研室副教授、教授、硕士生导师、教研室副主任。1999赴美国Robert Wood Johnson Medical School, University of Medicine and Dentistry 做高级访问学者一年，分别在其所属的病理学系和Cancer Institute of New Jersey考查美国病理学教学现况及进行肿瘤分子免疫学研究。现任复旦大学上海医学院病理学系教授、博士生导师；中华医学会上海分会病理专业委员会委员、肝病专业委员会委员。

主要从事肿瘤标志物，肿瘤分子病理和肝病病理方面的科研工作，并负责复旦大学附属华山医院外科病理的诊断工作。主讲“病理学”、“基础病理学理论与实践”、“现代组织化学”等课程。在肝癌发生、发展，肿瘤免疫，肿瘤分子病理方面发表“Fibrobectin nd Malignant Disease-associated DNA-binding Protein 2 in Hepatocarcinogenesis in Rats”、“Enhancement of MHC-unrestricted cytotoxic activity of human CD56+ CD3- natural killer (NK) cells and CD3+T cells by rhamnogalacturonan: target cell specificity and activity against NK-insensitive targets”、“Chemospecificity and Cross-Reactivity of Target Cell Recognition by Human CD56+ NK and LAK Cells”等论文27篇，其中国外杂志发表14篇，12篇被SCI收录。曾主持国家自然科学基金两项，上海市重点项目一项。获上海市科技进步二等奖一项，全国第五届青年科技论坛三等奖一项。