一种构建重组质粒的简便方法

　　

克隆的道路有很多条，比如TA克隆、不依赖连接反应的克隆（LIC）、重组酶依赖的克隆等等。TA克隆和LIC都需要末端修饰，而这种修饰不容易被凝胶电泳等技术检测。重组酶通常又是和克隆试剂盒捆绑销售的，因此研究人员也很难优化重组反应。于是，美国艾默里大学生物化学系的Anton V. Bryksin和Ichiro Matsumura开发出一种PCR介导的克隆方法-重叠延伸PCR克隆（Overlap extension PCR cloning），相当简单且可靠。

克隆过程如下：一开始用嵌合体引物进行PCR扩增，产生了线性的插入片段，且片段两端都有载体序列。然后将载体和插入片段混合，变性并退火，随后将载体作为模板，用Phusion DNA聚合酶延伸杂交后的插入片段，直到聚合酶到达插入片段的5’端。在几轮PCR循环后，反应的终产物是带有两个缺口（每条链一个）的双链融合质粒。利用DpnI限制性内切酶消化，除去母板质粒，新质粒则转化到大肠杆菌中，DNA修复酶将缺口封住。

研究人员在反应中使用的是NEB公司的Phusion DNA聚合酶，他们认为这很关键，因为此酶保真度高，且不拥有链置换活性。研究人员还比较了五种不同的DNA聚合酶，认为这个最好。反应中只需要DNA聚合酶，而不再需要操作多个限制性内切酶、重组酶、连接酶和糖基化酶等。

在原理验证的实验中，研究人员首先克隆了gfp。他们认为，高浓度的插入片段和相对低的退火温度（比计算出的退火温度低5-10°C）对于高效的重叠延伸是很重要的。转化后的重组子有98%以上呈绿色，说明克隆错误和原始载体的残留极低。

研究人员还比较了PCR循环数对克隆效率的影响。他们发现：在最初15个循环，重组克隆数量不断增加，在17-18个循环达到高峰。之后的循环导致克隆数量略微下降。随后，他们还比较了三种不同的载体：插入片段比例（1：5、1：50和1：250）。他们发现，1：250的比例产生了最多的重组克隆。

他们应用这种克隆方法克隆了4个基因：gfp（1 kb）、gusA（1.9 kb）、lacZ（3.2 kb）和整个luxABCDE操纵子（6 kb）。他们利用限制性酶切分析和报告蛋白功能来验证了所有重组质粒的正确结构。此方法的错误率低于3%，而与片段大小无关。不过，研究人员观察到，随着片段长度的增加，转化后的克隆数量下降。曲线图暗示插入片段的上限是6.7 kb。（生物通 薄荷）

原文摘要：

Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids

BioTechniques, Vol. 48, No. 6, June 2010