百人博士两篇文章：如何研究细胞关键蛋白

　　

生物通报道：来自中科院上海生科院生化与细胞所的研究人员利用多种细胞蛋白分析手段发现了两种关键细胞蛋白的作用机理，这两种蛋白分别是C末端Src激酶（C-terminal Src kinase，Csk）和细胞极性封闭蛋白Occludin。研究论文分别发表在《Proteomic》和《Developmental Cell》上。

领导这些研究的是生化与细胞所陈正军研究员，其早年毕业于第二军医大学，后获国家教委青年奖学金赴德国学习，2001年入选****受聘于中科院上海生科院生物化学与细胞生物学研究所，主要研究方向是磷酸化蛋白质细胞信号网络与肿瘤发生。

在第一篇文章中，研究人员利用蛋白质组学分析了C末端Src激酶Csk，Src家族包括原癌基因src，yes，lyn，fyn，lck，blk，fgr，bcd和yrk编码蛋白，它们都有TPK活性．共同参与细胞转化的信号转导过程。Csk是Src同源家族激酶，是最重要的负调控因子之一，了解Csk相关的蛋白对于认识Csk的功能和信号传导具有重要的意义。

研究人员利用直接蛋白质组学方法识别了151个新蛋白，之后利用生物信息学分析，发现这些识别出的蛋白包含有一个或者多个Csk－SH2结合位点，这说明这些蛋白与Csk有潜在直接相互作用关系。

并且研究人员还利用生物化学的方法确认了四个蛋白：Par3, DDR1, SYK，以及蛋白激酶C iota与Csk－SH2结合位点的相互作用，最后通过免疫荧光实验，研究人员发现了Csk与Par3之间的作用模式，这些一系列的实验手段得出的数据，都为Csk研究提供了重要进展，这种新蛋白作用模式也为细胞调控提出了新观点。

另外一篇文章中，研究人员发现，重要的细胞紧密联接蛋白，又称封闭蛋白(Occludin)，在上皮细胞的定向迁移过程中定位于迁移的上皮细胞的迁移前缘，可能参与细胞定向迁移的极性的形成和稳定，由此调控细胞定向迁移活动。

细胞迁移是一种非常重要的细胞活动现象，它在生物体发育过程以及机体稳态维持方面起着非常重要的作用，也和许多疾病的发生发展紧密相关。细胞迁移过程及其分子调控网络非常复杂，迄今为止，迁移细胞的极性如何形成，极性蛋白如何被招募到上皮细胞迁移前缘等机制，以及极性蛋白的下游信号传导通路仍很不清楚。

研究人员通过细胞生物学和原子粒显微镜等一系列技术和方法发现了四次跨膜封闭蛋白Occludin定位并富集于迁移的上皮细胞前缘，Occludin表达被干扰后，明显影响其在细胞迁移前缘的定位，并造成细胞微管组织结构紊乱，同时微管组织中心(MTOC)重定向也明显异常；分子机制的研究结果证明Occludin能与aPKC和PI3K结合，且激活aPKC和PI3K信号通路，借此可能参与调控了微管组织中心定位、细胞骨架组织和细胞伪足突触伸展等过程。

这些研究发现提高了人们对迁移细胞极性的形成和稳定，以及细胞生命活动—细胞极性和细胞迁移—内在生物学相关性的认识，同时也为了解胚胎发育过程和愈伤过程增添了新的内容。

之前陈正军研究组还揭示了Cdc42在肝脏再生过程中担负的重要功能，Cdc42在肝细胞中的功能调控是一个复杂的网络，可能涉及到多种不同的细胞内功能和复杂的信号分子通路，对这些问题的阐释对于我们更深入理解肝脏的生理功能和发病机理具有重要的指导意义。

（生物通：万纹）

原文摘要：

The Tight Junction Protein, Occludin, Regulates the Directional Migration of Epithelial Cells

Cell polarity proteins regulate tight junction formation and directional migration in epithelial cells. To date, the mechanism by which these polarity proteins assemble at the leading edge of migrating epithelial cells remains unclear. We report that occludin, a transmembrane protein, is localized at the leading edge of migrating cells and regulates directional cell migration. During migration, occludin knockdown disrupted accumulation of aPKC-Par3 and PATJ at the leading edge, and led to a disorganized microtubule network and defective reorientation of the microtubule organization center (MTOC). Phosphorylation of occludin at tyrosine 473 residue allowed recruitment of p85α to the leading edge via association with its C-terminal SH2 domain. Loss o

f occludin attenuated activation of PI3K, leading to disorganization of the actin cytoskeleton and reduced cell protrusions. Our data indicate that occludin is required for the leading-edge localization of polarity proteins aPKC-Par3 and PATJ and promotes cell protrusion by regulating membrane-localized activation of PI3K.

Proteomic, functional and motif-based analysis of C-terminal Src kinase-interacting proteins.

C-terminal Src kinase (Csk) that functions as an essential negative regulator of Src family tyrosine kinases (SFKs) interacts with tyrosine-phosphorylated molecules through its Src homology 2 (SH2) domain, allowing it targeting to the sites of SFKs and concomitantly enhancing its kinase activity. Identification of additional Csk-interacting proteins is expected to reveal potential signaling targets and previously undescribed functions of Csk. In this study, using a direct proteomic approach, we identified 151 novel potential Csk-binding partners, which are associated with a wide range of biological functions. Bioinformatics analysis showed that the majority of identified proteins contain one or several Csk-SH2 domain-binding motifs, indicating a potentially direct interaction with Csk. The interactions of Csk with four proteins (partitioning defective 3 (Par3), DDR1, SYK and protein kinase C iota) were confirmed using biochemical approaches and phosphotyrosine 1127 of Par3 C-terminus was proved to directly bind to Csk-SH2 domain, which was consistent with predictions from in silico analysis. Finally, immunofluorescence experiments revealed co-localization of Csk with Par3 in tight junction (TJ) in a tyrosine phosphorylation-dependent manner and overexpression of Csk, but not its SH2-domain mutant lacking binding to phosphotyrosine, promoted the TJ assembly in Madin-Darby canine kidney cells, implying the involvement of Csk-SH2 domain in regulating cellular TJs. In conclusion, the newly identified potential interacting partners of Csk provided new insights into its functional diversity in regulation of numerous cellular events, in addition to controlling the SFK activity.

作者简介：

陈正军

1983毕业于第二军医大学；1989年获得国家教委青年奖学金赴德国学习；1993在德国乌尔姆大学获得博士学位，并在乌尔姆大学血液肿瘤研究所任博士后；1995年起在德国马普科学院生化所(Max-Planck-Institute of Biochemistry)历任博士后、高级研究人员和课题负责人。2001年3月作为”****”入选者受聘于中科院上海生科院生物化学与细胞生物学研究所，任研究员，博士生导师。

研究方向：磷酸化蛋白质细胞信号网络与肿瘤发生

研究工作：

细胞极性与细胞迁移、增殖和肿瘤发生的相关性研究：

(1)生长因子受体信号通路调控的细胞极性蛋白酪氨酸磷酸化的生物学功能研究；

(2)细胞极性蛋白复合物Par3-Par6-aPKC及其功能相关蛋白在上皮细胞极性中的功能研究；

(3)研究Par蛋白复合物及其功能相关蛋白对细胞迁移，增殖及肿瘤发生发展中的影响；

(4)研究其他RTKs在上皮细胞极性中的生物学意义。

酪氨酸激酶细胞信号通路研究：

(1)生长因子受体信号通路在肿瘤发生发展中的作用机理研究；

(2)膜结合酪氨酸磷酸化蛋白功能分析及其跨膜信号转导作用机理研究；

(3)胰岛素信号通路生物学功能及其在糖尿病发生中作用机理研究。

磷酸化蛋白质组学研究：

(1)磷酸化蛋白质组学技术方法的研究和发展；

(2)肝癌磷酸化蛋白质组学研究；

(3)肝癌发生发展过程中的蛋白质差异表达研究