专家解析单细胞分析技术（一）

　　

生物通报道：随着对细胞生理研究的逐渐深入，科学家们开始解析单个细胞的行为，这是因为即使是同样的遗传物质，同样的周边环境，这些细胞还是会朝着不同的方向发展，有时还会生成不同的功能，而且单个细胞的变化还关系到癌症，神经疾病等疾病。

然而要分析单个细胞，却不是那么容易的事情，在基因表达分析中占据主要位置的DNA芯片这种分析方法，由于灵敏度不够，所以不足以发现单个细胞水平上的差异，但是从单个细胞中挑选少量RNAs，或者蛋白也不容易做到，而且如果还要分析细胞的动力学因素，那就不只是繁琐实验的问题，还需要物理学，机械学，和生物学的多方配合。

来自斯坦福大学的单分子研究专家Stephen Quake研究组在单分子实验中也遇到了相同的问题，他们希望能检测相同细胞对于相同信号的反应，之前研究人员已经利用定量PCR进行了批量分析，但是他们还是希望能就单个细胞如何对不同浓度的信号分子TNF-α产生相应的响应进行分析。

细胞信号交流调控着基本的细胞活性以及人体中相应的细胞活动。细胞准确应答周围环境的能力是发育、组织修复和免疫的基础。深入理解细胞间的相互交流将有助于了解生物系统的复杂性，或能开发出癌症，糖尿病及其他自身免疫疾病的新疗法。

因此Quake研究组探索出来一种新方法来观察单一细胞在细胞信号复杂系统中的应答反应，这种方法就是高通量的微流体细胞培养(high-throughput microfluidic cell culture)，将这一技术与荧光显微镜，定量基因表达分析和建立数学模型等研究手段结合起来，Quake研究组首次发现相同细胞之间存在大范围的差异，并且指出了科学家的一些认识可能已经被基于细胞群体研究的结果所误导。

细胞活化这一结果是一样的，然而细胞达到结果的过程可能是不一样的，群体研究不能显示信息错综复杂的信号网络中的差异，而这在单一细胞水平中可以观察到。

研究人员利用不同的蛋白浓缩物刺激细胞，这些浓缩物是免疫系统应答炎症或癌症反应的代表性物质。结果发现，一些细胞接受信号并被激活，而一些细胞则没有激活。研究人员人员观察到细胞以不同的方式产生应答，但是细胞的基本反应在许多方面是一致的。

这种方法的优势是效率十分高——利用这种方法，研究人员能同时处理成百上千的细胞，并且观察长达4天的时间里，这些细胞的反应。而缺点就是微流体实验并不容易操作，因此一定要考虑清楚。如果你希望观测细胞对于一个信号刺激的反应，那么也许一个96孔板就能搞定，但是如果你希望了解细胞在系列环境中的反应，那么微流体实验也许更加合适，具体来说还得看个人的情况。

Quake研究组今年在单分子研究方面还获得了另外一项重要的成果：他们发展了一种平价的单分子光谱技术，所谓单分子光谱，其实主要用来研究纳米领域，其基本观念非常简单：就是一次只观测一个生物分子或纳米粒子，因此可以轻易观测到很多分子尺度的动态过程，蛋白质分子折迭(folding)即为一例。为了达到单分子光谱的灵敏度，关键之一就是要利用高数值孔径(numerical aperture, NA)的物镜来聚焦及收光，然而高NA的物镜价格相对昂贵，而且还会衍生一些实验测量上的问题。

为了解决这一问题，以及无法做长时间观察，观察视野较小及工作距离较短的问题，研究人员将具有高折射率的二氧化钛(TiO2)微米球放在单荧光分子及物镜中间，让TiO2微米球们扮演微透镜(microlens)的角色，将荧光分子所发出的光聚焦至物镜。这种结合微透镜及平价低NA(=0.5)物镜的作法，可侦测单分子讯号而不会有热效应的问题，因此能做长期观测。他们利用这项技术成功地在70°C的高温下，观察到单一酶的活动过程。

（生物通：张迪）