Methods：荧光成像技术（一）

活体动物体内光学成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt及dyes等）进行标记。利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。

　　

生物通报道：活体动物体内光学成像(Optical in vivo Imaging)主要包括体内成像和体外成像两个方面，其中体外荧光显微技术一直以来都是现代生命科学研究的基础之一：给荧光基团配上一个合适的配体，比如抗体或者量子点，然后将其与组织样品或者细胞培养物一起温育，最后加上光照，这样标记的分子就能通过显微镜显示出来。但是体外方法有一个“致命伤”——不能在天然环境下描绘生物过程，因此研究人员逐渐从体外观测转向对体内生物体过程的研究。

而体内荧光成像则包括生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt及dyes等）进行标记。利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过这个系统，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。

荧光成像方法由灵敏的CCD及其分析软件和作为报告子的荧光素酶（luciferase）以及荧光素（luciferin）组成，可以直接对活体生物体内的细胞活动和基因行为进行监控，适合于观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。这种方法可以对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标（标记细胞及基因）的移动及变化，因此比较于传统的动物实验方法，所得的数据更加真实可信。

技术原理

标记原理——哺乳动物生物发光，是将Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在ATP及氧气的存在条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。对于细菌，lux操纵子由编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成，带有这种操纵子的细菌会持续发光，不需要外源性底物。

基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。标记细胞的方法基本上是通过分子生物学克隆技术, 将荧光素酶的基因插到预期观察的细胞的染色体内，通过单克隆细胞技术的筛选, 培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。目前, 常用的细胞株基本上都已标记好, 市场上已有销售。 将标记好的细胞注入小鼠体内后, 观测前需要注射荧光素酶的底物—荧光素，为约280道尔顿的小分子。荧光素脂溶性非常好, 很容易透过血脑屏障。注射一次荧光素能保持小鼠体内荧光素酶标记的细胞发光30-45分钟。

光学原理——光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。在偏红光区域, 大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。在相同的深度情况下, 检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系。可见光体内成像技术的基本原理在于光可以穿透实验动物的组织并且可由仪器量化检测到的光强度，同时反映出细胞的数量。

技术难点

尽管这种技术具有操作简单，结果直观，灵敏度高等优点，但是仍然也存在许多问题，任何荧光成像的实验手册也都有一些troubleshooting，比如荧光基团不稳定啊，交联配体的结合特异性差啊，或者信号水平不高等等。这也难怪，因为对于体内成像技术而言，光需要绕很多道“弯”才能到达组织，获得图像，而且由于组织会吸收和散射一些光，因此实验手册都需要确保激发的光源能到达荧光标记物，并且这些荧光也要能从生物体外观测到。

不过利用一些方法和手段能避免以上的这些问题，目前研究人员常采用生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET）的方法进行组织成像。不同于利用生物体外激发光源的能量转移方法，BRET主要依赖于生物发光的荧光素酶来提供荧光标记需要的能量转移。一般而言，进行BRET实验的研究人员是将与荧光素酶与荧光蛋白相交联，后者会吸收生物荧光，并重新发出光，但是由于这些BRET交联物的光仍然有大部分会被吸收和散射掉，因此剩下的信号依然很弱。

为了解决这一问题，一些厂家推出了相应的产品，比如将荧光素酶交联在quantum dots (QDs)，而不是荧光蛋白上，这就将发出的光线变成了依然是长波长，但吸收和散射不强的光。

这种新型的荧光探针就是量子点Qdot或称为半导体纳米晶体，所谓Qdot，指的是准零维(quasi-zero-dimensional)的纳米材料，由少量的原子所构成。粗略地说，量子点三个维度的尺寸都在100纳米(nm)以下，外观恰似一极小的点状物，其内部电子在各方向上的运动都受到局限，所以量子局限效应(quantum confinement effect)特别显著。

这种纳米材料对于体内光学成像来说有着得天独厚的光学特点，这就是吸收性高、量子产量高、发射谱带窄、斯托克司频移大以及光褪色抗性强等，能够发射不同波长光谱，可以为单一波长所激发，适用于在一个实验中检测多靶点，因此非常适合活细胞成像和动态研究，甚至有人认为这种纳米荧光是纳米技术的真正代表，给荧光技术带来革命性的突破。

目前市面上此类染料并不是十分常见，经典的纳米荧光染料主要来自同名注册的公司：Quantum Dot公司，这家公司注册于1998年，创办者是麻省理工学院的Moungi Bawendi和加利福尼亚大学的Paul，这家公司由此在财政上获得3，750万美元的利润，《财富》还将这一项技术列为2003年具有突破性的尖端技术之一。目前这家公司已被Life Technologies（原Invitrogen）公司以八位数的金额收购了。

Quantum Dot公司相应的Qdot系列产品能满足流式细胞术、荧光显微镜、激光共聚焦、甚至Western Blot的检测需求。价格方面也不是很贵，在体内成像方面有需要的实验人员可以考虑一下。

另外松下（Matsushita）公司也开发出了用于研究的Qbead微珠的装置，可以配合Qdot的使用，其中多达200个独特标记的微珠吸附在探针上并结合了Qdot，使研究人员可以在一个样品中检测超过200个不同基因。这个系统可以让研究者一天从几千个样品中检测数百个基因。而且这种微珠有足够的灵敏度可检测少至100，000个RNA分子，这比微阵列方法灵敏得多，同时针对Qdot，Matsushita也设计制造出了Quantum Dot Mosaic Q100扫描仪。

（生物通：万纹）