xCELLigence系统实时检测神经毒性[创新技巧]

本研究中，我们使用xCELLigence系统，对类神经元细胞HT-22，及原代培养大鼠皮质神经元细胞，对不同细胞死亡刺激物的反应进行了研究。研究表明，xCELLigence系统可通过多方面实验，持续对神经细胞培养进行监测，所进行的实验包括接种反应板、预培养、增殖胶质细胞的去除、药物作用，以及对神经毒性与神经保护作用的确认。

Sebastian Diemert、Julia Grohm、Svenja Tobaben、Amalia Dolga、Carsten Culmsee
德国 Philipps- University Marburg，药理学与临床药学研究所。

关键词：
神经细胞死亡、xCELLigence系统、原代皮质神经元细胞、HT-22 细胞、细胞阻抗、实时测定

前言
在很多神经退化性疾病中发现了神经元凋亡与坏死。近几年来，神经科学研究中建立了几种细胞培养模式，用于体外细胞死亡机制的研究。尽管近年来科学界对神经元细胞死亡信号传导原理已经得了一定成果，但技术上的局限性依然存在，从而限制了对数据的采集与解读。而无法进行神经细胞死亡的实时监测是一个主要的技术瓶颈。目前为止，主要的细胞增殖、细胞生存与细胞死亡检测方法均为侵入式终点检测，通常对细胞有毒性，并需要对细胞进行破坏处理。

同时，对神经细胞死亡与潜在机制进行动态变化分析，需要大量的实验操作，涵盖持续的、多个时间点。目前有几种终点实验法，可进行特定凋亡时间点上的特异性分子事件的检测，如磷脂酰丝氨酸转位至细胞膜外部，线粒体功能障碍、半胱氨酸蛋白酶激活，以及 DNA 断裂（1）。这些终点测定的一个缺陷是，其无法确定实验凋亡时间点。为解决这个问题，研究人员需要重复对细胞死亡形态学改变进行监测。

目前，使用由罗氏与 ACEA Biosciences公司联合开发的实时细胞分析仪（Real-Time Cell Analyzers，RTCA）xCELLigence系统，应用非侵入式、无标记性技术，可对细胞进行持续监测。xCELLigence系统对将传感器微电极点阵整合入E-Plate 96培养孔底部，并对生长于上的细胞阻抗进行记录。阻抗测定记录的是细胞指数（Cell Index，CI）值，细胞贴附于电极后，当细胞形态学发生变化，会导致电流环路电阻改变，该电阻与细胞指数具有相关性。通过对细胞形态学改变、细胞粘附与细胞增殖的监测，xCELLigence 系统可追踪细胞变化与细胞死亡情况。

本研究中，我们使用xCELLigence系统，对类神经元细胞HT-22，及原代培养大鼠皮质神经元细胞，对不同细胞死亡刺激物的反应进行了研究。原代培养神经细胞的一个特征是其浓密的树突状网络，该网络在凋亡诱导后，可残留于组织反应板上。无论细胞本身是否已发生凋亡，凋亡神经元可残留贴附于细胞培养板上，并显示出一定的阻抗性。这种特性对原代神经元培养监测的影响，也是本次使用RTCA仪器进行研究的一个热点。而且，我们对xCELLigence系统对神经保护作用的监测能力进行了研究。出于这个目的，我们使用神经保护剂BI-6C9，BI-6C9是一种公认的BH-3 小分子抑制剂，可与死亡激动剂（domain death agonist，BID）发生相互作用，是 Bcl-2基因家族的预凋亡成员（4，5）。

总之，研究表明，xCELLigence系统可通过多方面实验，持续对神经细胞培养进行监测，所进行的实验包括接种反应板、预培养、增殖胶质细胞的去除、药物作用，以及对神经毒性与神经保护作用的确认。

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材料与方法
HT-22类神经元细胞
按照指定密度接种 HT-22细胞于 96-孔 E-反应板 96 （罗氏）或常规96-孔反应板（Greiner，Frickenhausen）上，并生长于 DMEM培养基 （德国 Karlsruhe，Invitrogen 公司）中，培养基中添加有10%热失活胎牛血清（FCS）、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml链霉素与 2 mM 谷氨酸 （德国 PAA Laboratories 有限公司）。

原代皮质神经元培养
如前述，原代皮质神经元细胞来自于胎鼠大脑 （E16-18）（4）。简言之，即分离皮质组织、轻柔胰酶消化后，机械分离神经元，并去除脑膜。将不同密度细胞接种于聚乙烯亚胺 （polyethylenimine，PEI） 预包被 96-孔 E-Plates 96 （Roche） 或标准 96-孔板（Greiner）中。培养基为神经细胞培养基 （Invitrogen） 添加有 5 mM HEPES、1.2 mM 谷氨酸、2% （v/v） B27 补充剂 （Invitrogen） 与庆大霉素（0.1 mg/ml）。培养 48 小时后，使用胞嘧啶-阿糖胞苷（cytosine-arabinofuranoside，CAF）处理 48 小时，抑制非神经元细胞的生长。然后，体外培养 6-7 天后，完全更换培养基，将神经元细胞用于下述实验。为对谷氨酸处理神经元细胞CI 值的改变进行监测，必须于培养第0天，于细胞中添加 1 µM CAF。

细胞增殖检测
根据细胞增殖试剂盒I （MTT）（罗氏）的说明书，通过比色MTT（3-[4,5-二甲基砷-2-yl] -2,5-溴化噻唑蓝四氮唑） 检测，对神经元细胞活性进行检测。通过自动FLUOstar Optima 读取仪（德国 Offenburg ，BMG Labtech）进行 570 nm培养孔的吸光度读取，参考过滤波长是 630 nm。

实时细胞分析
使用 xCELLigence RTCA MP 仪器与 RTCA 软件1.2 进行 CI 值测定，并于 E-Plate 96 中进行持续监测。用100 µl DMEM含10% FCS进行HT-22细胞培养的背景阻抗检测，用100 µl 神经细胞基础培养基含2% B27进行神经细胞培养的背景阻抗检测。PEI 包被不会干扰细胞阻抗测定。相反，多聚-D-赖氨酸或多聚-L-赖氨酸包被可显著干扰原代皮质神经元的实时监测。对 HT-22 细胞持续监测 2 天，对原代皮质神经元细胞持续检测 12-14 天。

荧光与光学显微镜 – 于 PEI包被 IbiTreat µ-Slide 8-孔反应板（德国Munich，Ibidi） 上培养皮质神经元细胞，培养 6 天。然后，将培养细胞固定于 +4°C 磷酸缓冲液（PBS）（pH 7.4） 多聚甲醛中。使用 0.2% Triton X-100/PBS 对神经元细胞进行透化处理，使用 10% （v/v） 标准山羊血清（NGS）与2% （v/v） 牛血清白蛋白 （BSA）PBS，于室温处理 1 小时进行终止。+4°C 环境下，将神经元细胞与神经元标志微管相关蛋白 2 （microtubule-associated protein 2，MAP-2） （英国剑桥Abcam，ab11267， HM-2，1:600 稀释）小鼠单克隆抗体共同孵育，孵育过夜。第 2 天，将细胞与山羊抗小鼠二抗（Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse IgG （H+L） （Invitrogen，1：250 稀释）共同孵育。使用DMI6000 B 倒置显微镜（德国，Leica ）收集荧光成像信息，LAS AF 软件（德国Mannheim，Leica Microsystems 公司Leica Application Suite, Advanced Fluorescence 2.2.0）分析。使用配备有 Lumenera Infinity 2 数字摄象机（加拿大 Ottawa，Lumenera 公司）的Axiovert 200 显微镜（德国 Jena ，Carl Zeiss ）获取光学显微镜的成像信息。10x 2.5 NA 物镜 （德国 Jena ，Carl Zeiss）采光，通过相差进行成像捕获。INFINITY ANALYZE 软件 （Lumenera 公司） 数字成像记录与成像分析。

结果
神经元 HT-22 细胞增殖
为对神经细胞系 HT-22 的生长与增殖情况进行评价，将细胞以不同密度（4500、8000 与 20000 细胞每孔） 接种于 E-Plate 96 上，并使用xCELLigence RTCA MP 仪器进行监测，监测 48 小时。首先细胞粘附于培养孔表面后，阻抗会显著增加，后期实验中，HT-22 细胞增长稳定。最终的各生长曲线，斜率非常相似，仅各培养孔绝对 CI 值不同，CI 值随各自接种密度的（参见图 1A 与 B）不同而不同。

为进行 HT-22细胞死亡诱导，使用不同剂量的谷氨酸（3 与 5 mM）。这些细胞中，谷氨酸可导致谷氨酰胺的消耗，从而促进活性氧的生成，导致线粒体损伤与细胞死亡（2，3）。谷氨酸处理后 8-10 小时期间，未检测到 CI 值改变。其后 4-6 小时期间，CI 值快速降低。阻抗曲线图反映出剂量依赖性的谷氨酸诱导的细胞死亡。阻抗测定后的E-Plate 96 反应板 MTT 实验结果进一步证实了本研究结果（参见图1C）。不同细胞接种密度与不同谷氨酸浓度下，细胞死亡的开始时间略有不同。如图 1B，xCELLigence记录阻抗图在药物给定时间点，对CI 值进行标准化。xCELLigence系统检测到的谷氨酸诱导的细胞死亡动态变化，同前期研究中谷氨酸诱导HT-22 细胞死亡的时间段及特征具有良好的重复性，包括线粒体断裂与细胞核 AIF 转位 （2，3，4）。

图 1：E-Plate 96 中的 HT-22 细胞浓度梯度，及谷氨酸毒性检测。（A） 将指定细胞密度的 HT-22 细胞接种于 E-Plate 96 上，并使用 xCELLigence 系统进行 48 小时记录。接种后 24 小时，使用谷氨酸对细胞进行处理。（B） HT-22 细胞指数 （CI） 值，在谷氨酸添加时间点进行标准化。（C） 持续性xCELLigence 细胞监测后，于 E-Plate 96 中进行 MTT 终点实验，对细胞活性进行检测。

xCELLigence系统神经保护作用检测
为测定xCELLigence 系统是否可检测神经保护作用，我们使用预凋亡BH-3 蛋白BID的小分子抑制剂，即 BI-6C9，来防止谷氨酸对 HT-22 细胞的毒性作用。如图 2A 所示，在HT-22细胞预先添加 3 mM或5 mM的谷氨酸的情况下，BI-6C9可有效防止谷氨酸诱导的 HT-22 细胞的凋亡。仪器记录的 BI-6C9 处理的细胞，无论是否添加谷氨酸，其CI 值均持续增加，表明BI-6C9 可维持细胞形态并延长细胞生存时间。而且使用实验终止后的E-Plate 96 孔板，及在实验时平行设置的附加标准 96 孔板，进行细胞增殖（MTT）实验，均验证了BI-6C9-介导的保护作用（参见图 2B）。这些结果进一步证实了xCELLigence系统可用于监测细胞活性。通过光学显微镜观察，将药物对 HT-22 细胞形态学的作用进行记录（参见图 2C）。添加谷氨酸后，细胞发生显著形态学改变，细胞固缩并从培养板脱落，阻抗降低。通过 xCELLigence 系统相应 CI 值监测记录，进一步证实了这种情况，监测记录表明，谷氨酸处理后，CI 值降低。然而在添加 BI-6C9 后，HT-22 细胞形态未改变，CI 值记录进一步证实了神经保护的作用（参见图 2A）。

图 2：细胞阻抗检测HT-22 细胞神经保护作用。（A）xCELLigence 系统对检测Bid 抑制剂 BI-6C9 的神经保护作用。接种后，使用 BI-6C9 与/或谷氨酸对 HT-22 细胞进行处理，记录 24 小时细胞指数（CI）值。（B）通过 MTT，对细胞活性进行检测，左侧列数据为E-Plate 96终止CI 后进行的检测，右侧列数据为标准 96 孔细胞培养板中进行的检测。（C）通过光学显微镜观察，记录药物对 HT-22 细胞形态学的作用。

原代皮质神经元培养
分离原代大鼠皮质神经元细胞（Primary rat cortical neurons，PCNs），并将其接种于PEI-包被的 E-Plate 96 孔板上，每孔接种的细胞密度不同，接种密度范围为 8000 至 32000 个细胞/孔。如图 3A 所示，PEI 包被不会干扰细胞阻抗的测定。在添加有2% B27 的神经基础培养基中培养 72 小时，原代神经元细胞对细胞培养的条件适应良好。xCELLigence 系统持续监测表明，可能是培养最初的几小时内，细胞贴壁、贴附于培养孔底部，CI 值在培养初期有一定升高。不同细胞密度孔中，通过 PCNs 微管相关蛋白 2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）染色，神经网络的显示非常清楚（参见图 3B）。为去除原代培养的皮质神经元细胞中增殖的胶质细胞，于培养第 3 天，使用 1 µM CAF，对培养的细胞进行处理，共处理 48 小时。如图 3B 所示，CAF-的处理可导致 CI 值轻微降低，极可能是去除增殖的胶质细胞的反映（参见图 3B）。

图 3：原代培养皮质神经元细胞的细胞浓度梯度。（A） 特定细胞密度下的原代皮质神经元（PCNs）细胞进行培养，使用xCELLigence系统进行持续 6 天的记录。原代分离后， PCNs 用3 天的时间适应细胞培养E-Plate 96 孔板环境。使用 CAF 处理 48 小时，以去除增殖的胶质细胞。然后继续培养 24 小时，以便于细胞恢复。（B） xCELLigence 记录显示CAF-处理对 PCN 细胞的效应。在CAF添加的时间点对细胞效应进行标准化。（C） 不同细胞密度下神经元细胞 MAP-2 的染色图片。

为监测原代培养的神经元细胞的死亡情况（16000 个细胞/孔），使用钙离子载体或谷氨酸盐对细胞进行处理。细胞接种后155 小时后使用钙离子载体处理细胞，发现在添加后5 至6 小时，CI 值显著降低（参见图 4A）。与对照组纺锤状扁平小体相比，暴露于钙离子载体的原代培养细胞可见致密小体的出现（参见图 4）。如图 4B 所示，谷氨酸盐处理后，48 小时至 72 小时期间 CI 值持续下降。尽管谷氨酸盐通过 NMDA 受体的激活，可使细胞内钙离子浓度快速增加，但与钙离子载体处理的细胞相比，后续的细胞死亡时间显著延迟（比较图片 4A 与 4B）。原因可能是，与钙离子载体处理导致的细胞膜完整性的快速丧失以及细胞坏死相比，谷氨酸盐导致细胞死亡信号的激活会稍延迟。与以上发现一致，光学显微镜检查显示，相比与钙离子载体处理的细胞，谷氨酸盐处理的培养神经元细胞形态学改变的程度更小（参见图 4C），这与 xCELLigence 系统的动态记录结果一致。

图 4：原代皮质神经元细胞检测细胞死亡。（A）于培养第 6 天使用钙离子载体对皮质神经元细胞进行处理，使用 xCELLigence 系统继续监测 3 天。（B）培养第 6 天时，去除生长因子，使用谷氨酸对原代皮质神经元细胞进行处理，继续监测 6-8 天。（C）通过光学显微镜的观察，记录药物对原代皮质神经元细胞的作用。

结论
细胞退化与神经细胞死亡通常与急、慢性退化性功能障碍疾病相关，如中风、帕金森症与阿兹海默症。对神经细胞潜在细胞死亡机制的研究是确定神经退化性疾病原因及治疗措施的前提，也是研究人员的兴趣所在。本研究中，我们检测了公认的神经细胞培养模型是否可用于xCELLigence 系统，且是否可进行体外神经毒性与神经保护作用的研究。

研究发现，使用xCELLigence系统可对 HT-22 细胞与原代皮质神经元细胞的神经毒性作用进行持续监测。谷氨酸处理 HT-22 细胞后，可快速启动神经细胞死亡，并导致其发展，因此传统上很难确定进行终点法检测的理想时间点。xCELLigence 通过记录的阻抗 CI 值，实时显示了神经毒性作用，并对何时进行下游蛋白质组学与基因组学终点检测进行了精确定位。而且，通过进行BID抑制剂BI-6C9 在神经防护作用的实验，进一步确定了xCELLigence系统在神经科学抑制剂研究中的适用性。更重要的是，xCELLigence 系统可使我们对整个实验中的原代皮质神经元细胞培养条件进行监测，包括反应板接种、预培养、CAF 处理去除胶质细胞、复合物添加，以及细胞死亡图。

总之，通过 xCELLigence系统，我们可以对神经细胞培养模型，即HT-22 细胞与原代皮质神经元细胞，其细胞培养条件进行监测。我们发现，相比于传统的终点检测，这种新的方法获取的信息更多，同时可降低实验本身及所投入的时间。而且，通过xCELLigence 系统，我们可优化进行终点分析的时间点，并深入研究神经细胞死亡的分子机制。因此，xCELLigence 系统可作为一种非常准确及方便的工具，很好地进行体外神经细胞死亡与神经保护作用研究。

参考文献
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3. Grohm J, Plesnila N, Culmsee C. （2010）.
“Bid mediates fission, membrane permeabilization and peri-nuclear accumulation of mitochondria as a prereq¬uisite for oxidative neuronal cell death”. Brain Behav Immun 2009 Dec 2 [Epub].
4. Culmsee C , Zhu G, Landshamer S, Becattini B, Wagner E, Pellechia M, Blomgren K, Plesnila N. （2005）.
“Apoptosis-Inducing Factor Triggered by Poly（ADP- Ribose） Polymerase and Bid Mediates Neuronal Cell Death after Oxygen–Glucose Deprivation and Focal Cerebral Ischemia”.
Journal of Neuroscience 25（44）: 10262-10272.
5. Becattini B, Culmsee C, Leone M, Zhai D, Zhang X, Crowell KJ, Rega MF, Landshamer S, Reed JC, Plesnila N, Pellecchia M. （2006）.
6. “Structure–activity relationships by interligand NOE-based design and synthesis of antiapoptotic compounds targeting Bid”. Proc Natl Acad Sci USA. 103（33）: 12602-6.

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