高通量研究转录起始位点的新方法

日本横滨理化研究所的研究人员最近开发出一种高通量方法，来研究目的基因的转录起始位点。他们将这种方法命名为Deep-RACE。借助于最新的测序技术，这种新方法能平行分析多个基因，并省却了耗时的克隆步骤。与常规的RACE PCR产物测序相比，它更为准确和经济。

　　

日本横滨理化研究所（RIKEN Yokohama Institute）的研究人员最近开发出一种高通量方法，来研究目的基因的转录起始位点。他们将这种方法命名为Deep-RACE（Deep–rapid amplification of cDNA ends）。借助于最新的测序技术，这种新方法能平行分析多个基因，并省却了耗时的克隆步骤。与常规的RACE PCR产物测序相比，它更为准确和经济。

一直以来，5’-RACE PCR是特异扩增转录本5’端的公认方法，用于转录起始位点（TSS）的作图以及对启动子元件的大致定位。通常，作图是将5'-RACE PCR产物克隆到细菌载体上，并通过传统的Sanger测序对一些克隆进行测序。然而，选择性剪接、可变启动子以及多个TSS的出现增加了转录分析的难度。为了让5′-RACE PCR分析能反映这种多样性，需要对相当大的区域进行测序。当需要同时分析多个转录本时，这项工作就变得复杂和耗时，当然也花费更多。为了解决这种缺陷，Signe Olivarius和他的同事开发出一种简单的方法（流程如下图），能直接对5′-RACE PCR产物进行高通量测序，省却了耗时的克隆过程，并能对转录进行定量评估。

为了探索这种方法的可行性，他们在Hep G2细胞中选择了17个基因，并对RNA连接酶介导的RACE方法进行改进，以适于高通量的5’端测序。通常，测序中有样品制备步骤，将测序接头连接在DNA片断的两端。为了省略这个步骤，他们在inner PCR的引物5’端加上了20 bp的附加序列，作为Illumina Genome Analyzer测序仪的接头序列。在巢式PCR之后，对17个基因进行了inner 5′-RACE PCR反应，随后进行纯化，将纯化产物置于单个通道中，进行高通量的测序。他们获得了2,145,126个序列读长，其中1,280,189能用于作图。研究人员用Galaxy web service来鉴定基因组间隔。访问量超过500的TSS被选择和聚类，并向5’和3’方向各延伸了100 bp。这样产生了26个基因组间隔，用于过滤原始数据，并解救了访问量低于500的TSS。其中18个间隔与目的基因座一致，而其他的与基因组的重复区一致。每个基因平均被74000多个序列覆盖，即使覆盖率最低的基因，也有3195个标签，表明这种方法最多能发现几百个不同的非重叠转录起始位点。

研究人员表明，5'-RACE PCR与高通量测序结合的转录分析能大大增加序列数据的数量，同时节省相当多的时间和精力。将RACE PCR产物直接用于新一代测序，省却了繁琐的克隆步骤，同时引物的设计也替代了测序前的过夜连接。此方法简单易行，能同时对几百个基因的TSS进行平行分析。由于单次运行能获得几百万序列，当同时分析很多基因时，能对TSS位置和相对利用率进行非常可靠的评估。

这次用Deep-RACE仅仅对17个基因进行了测序，其费用与Sanger方法相当（仅就试剂而言，没有包括劳动力成本），说明高通量测序对于大规模的TSS研究是非常经济的。Deep-RACE的结果也能用绘图工具如Galaxy轻松分析。因此，Deep-RACE是对多个基因进行转录起始位点平行分析的理想工具。

（生物通 余亮）