高通量DNA测序技术在生物学研究的应用

　　

廖新化的博客

导读：有很多生物学工作者尽管知道高通量技术的大概原理，但是却以为它仅仅是更快而已。其实高通量DNA测序技术不仅仅是替换传统的测序技术，它有三大优点是毛细管测序法所不具备的。首先它把平行处理的思想用到极致，可以在几百万个点上同时阅读测序，所以它是快速高通量的技术，这一点是大家所熟知的；另外它实质上是单分子DNA的测序技术，通过单分子DNA结合在某个点上进行扩增测序，所以它可以测一个DNA的mixture（混合）；最后由于在一个mixture中某种DNA的丰度反应在它能在多少点上结合并被测序，也就是说被测序的次数反应了DNA的丰度，这个技术还有非常完美的定量功能。

高通量DNA测序技术已经在如下领域掀起了革命。
测基因组的：
1. re-annotation of the genome。测序难免有错误，通过反复的深度测序，可以将这种错误降低到很小。另外通过反复测cDNA library，纠正了以前splicing位点的错误。
大规模地，便宜地，快速地测物种的序列，比如果蝇的subspecies的序列，对于理解进化非常有必要。
2. 疾病相关基因以及突变的hot spot的发现。以前的测序可以通过设计很多已知基因的引物，对来自病人的很多sample的平行测序，可以发现它们突变的位点集中在哪里，然后通过其它功能实验（比如酶活变化，致癌能力）来确证。现在的测序技术可以cover whole exon。比如收集某个病症的1000个sample，通过对这些sample平行测序，有可能de novo地发现新的致病基因突变。同理，从phenotype到genotype（比如狗的个体大小，最简单的是单基因导致的），理论上如果收集足够的样本，就可以用统计去除个体差异的背景，分离到这个genotype。
3. 甲基化的pattern。通过亚硫酸氢钠处理后甲基化的胞嘧啶C不变，而普通胞嘧啶变成U的原理，可以定量地看在genome上DNA甲基化的pattern。

测cDNA的：
1. 现有的技术已经基本上取代了Chip-CHIP。以前array的CHIP，在定量方面有很大的缺陷，原来差异在100倍的，反应在信号的上的差异可能只有30倍，信号饱和。现在的技术是通过hit目的片段的次数来定量的，也就是表达量越高，基因越大，被测序的次数也越多。这种定量比CHIP要准确很多。
2. 完全并且更好地取代array。比如细胞分化过程，应激反应过程……中基因表达的变化。可以通过cDNA库的测序，更加定量地，可重复地记录这个过程。有些物种的array没有商业化，如果自己设计定制array成本很高。而深度测序技术无需自己定制array就可以直接进行。在这种情况下，现在的测序技术成本已经比array要低了。

总之，高通量DNA测序技术不仅只是来测基因组，它还可以作为readout。这个就是技术促进生物学研究的很好的例子。以前不敢想的，现在有办法做了。

另外提一句：深度测序技术的应用会越来越广泛，它会产生海量数据。以后纯粹靠生化或者分子生物学技术的实验室将会很难生存，这就是我认为以后每个学生物的学生都必须掌握生物信息学，统计学的重要原因。 
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