超越经典实验技术的基因表达系统

　　

生物通报道：来自加州理工大学，NanoString Technologies公司，系统生物学研究院ISB，华盛顿大学以及英国伦敦学院等处的研究人员公布了一项新的研究成果：一种新型基因表达系统，这一系统原理基于彩色编码（color-coded，生物通注）基因转录的数据检测，灵敏度比芯片更高（与实时PCR相近），能直接检测mRNA的表达水平，并且这一过程不需要酶学反应。这一研究成果公布在《Nature Biotechnology》在线版上。

 

领导这一研究的是以DNA测序仪的开发面知名的Leroy Hood博士，其于2000年设立了Institute for Systems Biology，网罗生物学、工学、计算机等不同邻域的研究人员140人，挑战系统生物学新领域。

 

这种新表达系统即NanoString的nCounter基因表达系统，这家风险公司的目标是将具有比现有的DNA芯片技术1更高灵敏度的新检测技术商业化。此项技术是在想要检测的分子上贴上被称为“条形码”的标签分子，通过读取标签分子的颜色序列，来正确掌握目标分子的数目。这项技术本来就是由率领ISB的DNA芯片研究班子的Krassen Dimitrov开发的。在众多的埋头于提高微阵列灵敏度的研究者当中，对该技术现状感到不满的Dimitrov在新创意受到鼓励的ISB找到了全新的方法。

 

在这篇文章中，研究人员将nCounter平台，与Affymetrix的GeneChip平台，以及ABI的TaqMan PCR，SYBR Green real-time PCR进行了比较，发现这一系统“比芯片系统更加灵敏，与实时PCR灵敏度相近”。

 

nCounter系统依赖于一种基因条码（gene barcode，生物通注），这个条码由一个短捕获探针——能与靶标mRNA退火配对的35-50个碱基，以及一个报告探针——与mRNA配对的另外35-50个碱基，并且与用特殊荧光基团标记的tag连接，共同组成。由于每一个转录本（transcript）具有一个不同的tag，因此即使是以溶液状态存在，也能很容易的区分开来，并且每检测到一种条码的次数能反映这一基因表达的水平。

 

研究人员对509个人类基因进行了分析——其中347个基因在之前有关脊髓灰质炎病毒（poliovirus，生物通注）感染细胞的研究中曾进行了分析，另外162个也用之前设计的探针进行了研究，并且研究人员也在实验中加入了另外15个对照基因。

 

通过在溶液中将524种基因探针的总RNA混和，研究人员将目标基因与探针杂交，然后利用亲和纯化去除了未杂交的探针，从而确保mRNA检测不受到干扰，进而检测每一种mRNA转录本被检测到的次数。

 

利用100ng的总RNA，研究人员能反复分析基因表达，而且结果也证明nCounter系统比芯片技术更加灵敏——nCounter检测了转录本88.4％，而Affymetrix的Human Genome U133 Plus 2.0 microarrays复合GeneChip的Two-Cycle Target labeling检测率为82.6％，这个灵敏度与TaqMan实时PCR相近。

 

同时，研究人员也通过了其它的实验来验证这一结果，他们对海胆胚胎中提取的总RNA的21种基因的表达进行了分析，结果也证明nCounter系统检测的基因表达模式与实时PCR的相似。

 

华盛顿大学的Roger Bumgarner表示，“在这篇文章中，我们发现（nCounter）技术能在一个单反应中分析许多基因，获得比芯片技术更好，媲美于qPCR的检测结果。”

 

“这一技术的关键在于能以相对低的成本进行大量的样品分析，因此将来可能会改变病患诊断的基因表达检测的格局。”
（生物通：张迪）

 

原文摘要：
Nature Biotechnology
Published online: 17 February 2008 | doi:10.1038/nbt1385
Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs
『Abstract』

名词解释：

1.脊髓灰质炎
　　脊髓灰质炎又称小儿麻痹症，是由脊髓灰质炎病毒引起的小儿急性传染病，多发生在＜5岁小儿,尤其是婴幼儿。病毒侵犯脊髓前角运动神经元，造成弛缓性肌肉麻痹，病情轻重不一，轻者无瘫痪出现，严重者累及生命中枢而死亡；大部分病例可治愈，仅小部分留下瘫痪后遗症。自从口服的脊髓灰质炎减毒活疫苗投入使用后，发病率明显降低。

　【病因】

　　脊髓灰质炎病毒是属于小核糖核酸病毒科的肠道病毒，病毒呈球形，直径约20～30nm，核衣壳为立体对称20面体，有60个壳微粒，无包膜。根据抗原不同可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，Ⅰ型易引起瘫痪，各型间很少交叉免疫。脊髓灰质炎病毒对外界因素抵抗力较强，但加热至56℃以上、甲醛、2％碘酊、升汞和各种氧化剂如双氧水、漂白粉、高锰酸钾等，均能使其灭活。 　 　【流行病学】

　　人是脊髓灰质炎病毒的惟一自然宿主，隐性感染（占99％以上）和轻症瘫痪型病人是本病的主要传染源，瘫痪型因症状明显而在传播上意义不大。本病以粪-口感染为主要传播方式，发病前3~5天至发病后1周患者鼻咽部分泌物及粪便内排出病毒，少数病倒粪便带毒时间可长达3~4月；密切生活接触，不良卫生习惯均可使之播散。人群具有普遍易感性，感染后获持久兔疫力并具有型的特异性。＜4个月婴儿有来自母体的抗体，故很少发病，以后发病率逐渐增高，至5岁以后又降低。

　　 本病广泛分布于全世界，温带地区流行高峰在5~10月，热带地区终年可见。由于减毒活疫苗的应用，发病率已明显下降，但我国仍为流行地区。1988年世界卫生组织提出2000年全球消灭脊髓炎，1989年又提出消灭本病的行动计划，我国政府对此极为重视，已动员全国做好疫苗接种工作，进行免疫强化措施。消灭本病将指日可待。