清华大学林章凛教授实验室高通量筛选新技术登上封面文章

　　

生物通报道：来自清华大学化工系生物化工研究所林章凛教授领导的研究小组构建了一种快速，高效，简单的新载体：pEAS，能有效的解决传统方法中细胞膜裂解费时费力的问题，为分子定向进化（directed evolution）高通量分析提出了一种新方法。这一研究成果公布在《Protein engineering Design & Selection》杂志（原名《protein engineering》）11月刊的封面上（见下）。

 

（图片来自PEDS，图片说明：构建高通量快速可重复性大肠杆菌原位裂解热诱导自溶性载体。
将Aspergillus fumigattus 中的一种酶amadoriase II，和枯草杆菌（Bacillus subtilis）中的lipase A的基因插入到构建载体中，并在BL21中表达，通过热诱导42°C（30分钟）后，可以从图中看到，比较于对照组（B和D），实验组（A和C）颜色变化明显。）

这一研究受到了国家973项目（生物催化剂改造方法学的基础与应用研究，2003CB716002）和863项目（2003AA214061）的资助。

在分子定向进化（directed evolution）研究中，常常会利用高通量筛选系统（high-throughput screening system）分析蛋白（酶）变种(enzyme variants)，当靶标蛋白（酶）在细胞内表达了之后，比如说将大肠杆菌作为宿主，常常需要用化学物质或者酶对细胞膜进行裂解，而这个过程十分繁琐，费时费钱。

林博士等人在寻找解决高通量筛选过程中大肠杆菌这一裂解问题的时候，偶然想到噬菌体的裂解基因，接着想能否将这些基因和物理信号诱导的启动子结合，最终发展出了一种高效和简便的裂解方法。

这一新方法比较于传统方法，更加快速——时间缩短到30分钟，而且效率高（裂解可达95％以上），另外由于只需热信号，无需外加试剂，因此操作方便。而这篇文章中则主要是改进了温度诱导的范围，将原先的菌生长温度从30度提高到37度，更便于应用，除此之外研究人员还用几个实例证明了其在各种筛选模式（培养皿、膜、96孔板）中的实用性。

目前这一技术已经授权给了欧洲的Dualsystems biotech（http://www.dsbiotech.com/index.php?id="23），产品命名为QuickLyse" vector pEAS-1a（p取自plasmid，EAS是e. coli autolytic systems的缩写。合起来是peas刚好是“豌豆”），国内的代理商为达科为生物技术有限公司。

（感谢原文作者林章凛博士对此文的支持）

（生物通：张迪）

附：

林章凛教授实验室链接：http://www.chemeng.tsinghua.edu.cn/scholars/linzhl/zhanglin.htm

原文摘要：

Facile, reagentless and in situ release of Escherichia coli intracellular enzymes by heat-inducible autolytic vector for high-throughput screening

In an effect to broaden the application of the heat-inducible autolytic vector pUC18-cI857/pR-SRRz-rrnB previously developed, a new vector pUC18-cI857/pR(T41C)-SRRz-rrnB (pEAS-1b) was quantitatively characterized under various growth temperatures, heat induction temperatures and durations, and IPTG (isopropyl β-D-thiogalactoside) induction times, after resolving its erratic lysis profile found previously. Escherichia coli BL21 cells harboring this vector grew well at temperatures <36°C, and lysed efficiently (97.0 ± 0.8%) just 0.5 h after heat induction at 42°C for 30 min when cell growth was performed at 35°C. Application of this autolytic vector either in 96-well plates, or on nitrocellulose membranes, or on agar plates led to facile, efficient and consistent release of intracellular recombinant enzymes (e.g., a lysis efficiency of 91.8 ± 1.1% was obtained in 96-well plates). Further application in directed evolution was illustrated by improving the thermostability of amadoriase using this vector. This reagentless and in situ cell lysis method has the potentials for lysis of miniaturized samples in clinical diagnosis and bioanalytical detection, and even for lysis of cells in the microarray format.