三聚氰胺门之蛋白检测技术大比拼

三聚氰胺门之蛋白检测技术大比拼

　　

从消化的角度来看，动物蛋白质比植物蛋白质更易消化和吸收。从蛋白质的氨基酸的组成种类上来看，人体蛋白质由20种氨基酸组成，其中12种氨基酸是人体可以通过自身生化反应合成的，被称为非必需氨基酸；还有8种氨基酸人体不能合成，必须从食物中摄取，被称为必需氨基酸。动物蛋白中，一般都含有人体必需的8种氨基酸，特别是蛋制品和乳制品，故一般来说动物蛋白营养价值比植物蛋白高。

正因为蛋白质有着如此重要的重要性及营养价值，蛋白质含量才成为食品检测中的重要指标。目前蛋白质含量检测的国标规定方法是凯氏定氮法。

凯氏定氮法原理：由于蛋白质是含氮的有机化合物，蛋白质平均含氮量约16%，经典的凯氏定氮法检测的原理其实是检测食品中氮的总含量。其基本过程是将食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。

从凯氏定氮法原理不难看出这种方法检测的是食品总氮的含量，如果认为加入含氮（或氨基）的化学品，这种方法是无法区别的，将化学品中含氮量直接折算成了蛋白质含量，从而达到了人为提高蛋白质含量目的。

目前为止已经被曝光的用于牛奶或其他食品掺假的化学品有：
甘氨酸 C2H5NO2，含氮量18.7％
尿素，CO(NH2)2，含氮量46％
三聚氰胺，分子式C3N3(NH2)3，含氮量66%。
凯氏定氮法是无法区别此类富含氮的化合物，那么有没有别的蛋白质定量方法可以识别此类“假蛋白”，准确测量食品中的蛋白质含量呢？

目前常用的蛋白质定量方法除凯氏定氮法外还有有以下五种：

紫外吸收法：
蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

优点：简便、灵敏、快速。对低浓度的盐，如 (NH4)2SO4等及和大多数缓冲液有一定的抗干扰能力。

缺点：测定准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，故测定样品时的要统一pH值。

双缩脲法（Biuret法）：
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。

干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

Folin－酚试剂法（Lowry法）：以最早期的双缩脲法为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2 反应，产生蓝色的反应物。但是与双缩脲法相比，Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA，Triton x-100，(NH4)2SO4等物质的蛋白不适合此种方法。

考马斯亮蓝法（Bradford 法）：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特点是，敏感度好，是Lowry 和BCA 两种测试方法的2 倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定１小时，方便结果；而且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。

缺点：使用不同蛋白质的标准品会导致同一蛋白样品的定量结果差异较大。

BCA（Bicinchoninine acid assay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2 反应产生Cu ，后者与BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法，操作简单，敏感度高。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。

BCA法示意图

各种蛋白质测定方法比较如下：

方法	灵敏度	时间	原理	干扰物质	说明
紫外吸收法	50～100mg，	快速 5～10分钟	蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收	各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸	测定准确度较差，干扰物质较多
双缩脲法（Biuret法）	1～20mg	中速 20~30分钟	多肽键＋碱性Cu2＋紫色络合物	铵盐；Tris缓冲液： 某些氨基酸	用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似
凯氏定氮法（Kjedahl法）	1～5mg，	费时 8～10小时	将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定	各种铵盐	用于标准蛋白质含量的准确测定；无法区别含氮化合物干扰；费时长
Folin－酚试剂法,, , （Lowry法）	～5mg	慢速 40～60分钟	双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原	铵盐；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇	耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化; 标准曲线不是严格的直线形式，且专一性差
考马斯亮蓝法(Bradford法)	1～5mg,	快速 5～15分钟	考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm	强碱性缓冲液；TritonX-100; SDS	较好的方法；干扰物质少；颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化; 标准曲线有轻微的非线性
BCA法	普通BCA为 20～200mg, 微量BCA为 0.5～10mg	较快速 40分钟内	在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+	螯合剂；略高浓度的还原剂	抗干扰能力强，

从以上各种蛋白质测定方法的比较，我们不难发现，考马斯亮蓝法（Bradford 法），BCA（Bicinchoninine acid assay）法由于其反应原理是反应物与蛋白质直接作用，对铵盐类等含氮化合物的抗干扰能力较强，可作为凯氏定氮法检测蛋白质含量时的补充验证手段。

使用化工原料搀入食品以达到提高蛋白质含量的作假手段，很大程度上是针对某种特定的检测手段如凯氏定氮法。只要明确了一种分析手段，就会找到相应的干扰物质用于提高蛋白质含量的检测值。

因此，在复杂混合物蛋白质含量检测上，应该首先通过实验验证，确定几个可用的检测手段，在实际应用中，做到几个检测手段联合应用，相互参照，将大大提高蛋白质测定的准确性。

最近几年，媒体还曝光过使用植物蛋白替代动物蛋白，还有的添加人工蛋白：即用各种来源的水解蛋白代替食品中的天然蛋白质。这种用其他蛋白质替代天然蛋白，提高产品蛋白质含量的的方法，单纯采用上述蛋白质含量检测手段是很难区分的。从营养学的角度讲，在食品中添加其他蛋白质以改善食品的营养价值，是可取而且应该鼓励的。但这种改善必须有严格的科学依据，而不是单纯提高总蛋白质含量的检测值以达到某些食品标准的要求。

在进行目标蛋白质分析的时候，一般采用HPLC或电泳方法将不同的蛋白质分离开来，并进一步确定目标蛋白质的含量。将为了区分食品中是否添加了非标称来源的蛋白质，从技术角度讲，可以通过类似的方法建立指纹图谱进行区分。不同来源的蛋白质种类与含量不同，通过确定主要蛋白质的存在与含量及相互之间的比例，可以确定这些蛋白质的来源。蛋白质混合物可以通过HPLC， MS， 2D等手段进行分离，从而进一步分析其主要组分的含量与相互之间的比例，从而建立某种食品如奶制品中的主要蛋白质成分指标。

如果说这些分析手段存在较大的技术困难，还有一种比较简单的方法来大概的确定其成分。我们知道，人食用蛋白质后，这些蛋白质经过消化最终变成氨基酸进入人体（未经消化的蛋白质直接吸收的可能性非常小，据信这也是蛋白质过敏的主要原因）。因此蛋白质的营养价值其本质上是其组成氨基酸的营养价值。而不同来源的蛋白质氨基酸比例与含量会有差异，通过将蛋白质彻底水解，并分析这些氨基酸的组成与相互之间的比例，可以区分牛奶中是否添加了其他来源的蛋白质。如果真的有人作假手段高明到氨基酸组成与天然来源的一致，单就蛋白质的营养价值上来说，也可以具有与天然产品具有类似的营养价值了。

综合来说，任何存在的检测手段都可能有相应的干扰手段来作弊，但通过建立相对完备的检测手段，可以增加作弊的难度并提高作弊的成本，当作弊成本超过其收益的时候，也就没有人作弊了。