董孟秋·科学：蛋白质组学新技术

　　生物通报道：来自美国斯克利普斯研究所（Scripps Research Institute）Salk生物研究院，加州大学圣地亚哥分校的研究人员利用一种蛋白定量分析新方法对长寿命线虫进行了研究，发现了能延长和缩短寿命的蛋白。这对于进一步丰富蛋白定量研究方面来说意义重大。这一研究成果公布在《Science》杂志上。

文章的第一作者是来自斯克利普斯研究所的Andrew Dillin实验室的董孟秋（Meng-Qiu Dong，音译）。

原文摘要：
Science 3 August 2007:
Vol. 317. no. 5838, pp. 660 - 663 DOI: 10.1126/science.1139952
Quantitative Mass Spectrometry Identifies Insulin Signaling Targets in C. elegans
[Abstract]

仅仅知道蛋白质的身份并不足以对蛋白质给出最终定论，因为蛋白质的浓度对于实现其在细胞中的功能来说极其重要，一种特殊蛋白质在浓度上的变化就能预示细胞的突变过程。因此，科学家能够对蛋白质的相对和绝对浓度进行测量，是很重要的事情。过去，科学家通常先进行二维(2D)凝较电泳，切断条带，再用质谱方法测量条带中的蛋白质。可是，这种方法不是很理想：既不是非常敏感，也不是非常精确。

蛋白组学中的方法一直在不断提高。基于高度敏感性和精确性的串联质谱方法，不需要凝胶，就可以获得相对和绝对定量的蛋白质结果。同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）和同位素亲和标签（iCAT）是这些新进展中的两大主力，这些技术具有较好的定量效果、较高的重复性，并可对多达四种不同样本同时进行定量分析。但是仍然存在不尽如人意的地方，需要不断改进。

在这篇文章中，研究人员利用一种蛋白定量分析新方法对长寿命线虫进行了研究，发现了能延长和缩短寿命的蛋白。这种新方法即质谱仪分析方法，他们利用质谱仪比较了带有daf-2突变的线虫和不带突变的线虫的蛋白质的量。识别出47个蛋白质在突变线虫中更丰富，另有39个蛋白质在突变线虫中的量不丰富。实验显示，有些蛋白质增加寿命、有些降低寿命。Stuart K. Kim在一篇相关的研究评述中写道：研究人员将继续改进这个方法，因为这个技术现在只能用来研究线虫基因组中不到10%的蛋白质。

以前科学家也曾了解带有daf-2基因突变的美丽线虫比没有突变的线虫的寿命长一倍。daf-2降低一个名为“类胰岛素信号发生”过程的活性，从而延长了寿命。
（生物通：万纹）

附：
蛋白质定量分析技术

实验一 双缩脲法测定蛋白质浓度

[原理]

双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。

双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。

[操作]

取中试管7支，按下表操作。



各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用540nm比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。

[计算]

(一)在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。

(二)从标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度(g／L)，并求出人血清样本的蛋白质

浓度。

(三)再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本的蛋白质浓度(g／L)。

[器材]

中试管7支，l毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计、坐标纸。

[试剂]

(—)6N NaOH：称取240g氢氧化钠溶于1000ml水中。

(二)双缩脲试剂：称取CuS04·5H2O 3.0克，酒石酸钾9.0 克和碘化钾5.0克，分别溶解后混匀，加6N NaOH l00ml，最后加水至1000ml，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。如有暗红色沉淀出现，即不能使用。

(三)0.9％NaCl。

(四)蛋白质标准液(10mg／m1)，称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0ml容量瓶中，淋洗称量瓶数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线，或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量，然后稀释成l0mg／m1作为蛋白质标准液。

(五)待测血清样本：将人血清或动物血清用生理盐水稀释10倍后再测定。



实验二 Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度

[原理]

蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。

[操作] 

取试管7支、编号、按下表操作：

生理盐水

生理盐水


立即混匀，在20℃～25℃水浴保温30分钟。用660nm比色，测定光密度值。

操作注意事项：

1． 按顺序添加试剂

2． 试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下（试剂甲）易被破坏，因此加试剂乙后要立即混匀，加一管混匀一管，使试剂乙（磷目酸）在破坏前即被还原。

[计算] 

(一)绘制标准曲线。以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 

(二)以测定管光密度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。

(三)再从标准管中选择—管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。

[器材]

(一)721型分光光度计

(--)恒温水浴箱

(三)中试管7支

(四)刻度吸管：1. 0ml二支；0.5ml一支；5.0ml一支。

[试剂]

(一)试剂甲

(1)4％碳酸钠(Na2CO3)溶液

(2)0.2N氢氧化钠溶液

(3)1％硫酸铜溶液(CuSO4·5H2O)

(4)2％酒石酸钾钠溶液(或酒石酸钾或钠)

在使用前(1)与(2)、(3)与(4)等体积混合，再将两混合液按50：1比例混合，即为试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。

(一)试剂乙：

(1)市售酚试剂在使用前用NaOH滴定，以酚肽为指标剂，根据试剂酸度将其稀释，使最后酸度为1N。

(2)或取Na2WoO42H2O l00g和Na2MOO3 25g。溶于蒸馏水700ml中，再加85％ H3PO4 50ml和HCl(浓)100ml，将上物混合后，置1000ml圆底烧瓶中温和地回流十小时，再加硫酸锂(Li2SO4H2O)150g，水50ml及溴水数滴。继续沸腾15分钟后以除去剩余的溴，冷却后稀释至1000ml然后过滤，溶液应呈黄色或金黄色(如带绿色者不能用)，置于棕色瓶中保存，使用时用标准NaOH滴定，以酚酞为指示剂，而后稀释约一倍，使最后酸度为1N。

(三)标准蛋白质溶液

用结晶牛血清白蛋白，根据其纯度用蒸馏水配制成0.25mg／ml的蛋白质溶液。(纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定)。

(四)待测样品：准确取血清0.1ml，置于50ml容量瓶中，再加0.9％NaCl溶液至刻度，充分混匀，也可以用尿液为样品。



实验三 紫外分光光度法测定蛋白质浓度

[原理]

蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据，但由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要准确定量，必需要有待测蛋白质的纯品作为标准来比较，或且已经知道其消光系数作为参考。另外，不少杂质在280nm波长下也有—定吸收能力，可能发生干扰。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶碱)的影响更为严重。然而核酸的最大吸收峰是在260nm。因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定OD260nm，与OD280nm。，然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。

本法操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收)，多用于纯化之蛋白质的微量测定。主要缺点：当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时，则产生—定误差，混有核酸时必须分别测定280nm和260nm两处的OD值，再按公式推算蛋白质含量。

[操作]

取试管7支，按下表操作：

0.4

3.6


各管混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以空白管调节零点，分别于280nm、260nm波长下测定各管光密度， 

[计算]

(一) 直接根据标准液与待测液的光密度值(OD280nm)，或从标准曲线，求得样本蛋白质含量。

以标准管各管光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线，然后根据测定管光密度值，直接查标准曲线求得样本中蛋白质的含量。

1． 选一种与待测样本蛋白质氨基酸组成相近似的蛋白质纯品，用生理盐水稀释至浓度为 lmg／m1，作为稀释标准蛋白质溶液。

2．用生理盐水稀释待测样本蛋白质至浓度约为lmg／m1，即为稀释样本蛋白质溶液。

(二)利用经验公式直接计算样本蛋白质含量，

准确吸取血清样本0.1ml，置于50ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度，即500倍稀释，在280nm和260nm两处波长分别测得光密度值、再按下列公式计算。

1、OD280／0D260＜1.5时，用Lowry-Kalokar公式：

样本蛋白质含量(mg／m1)＝1.45OD280一0.74OD260

2、OD280／OD260﹥1.5时，用Lamber-Beer定律计算：

样本蛋白质含量(mg／m1) = OD280／K×L＝（OD280／6.3×1）×10g／L

本实验样品：牛血清白蛋白E1%cm＝6.3（100ml／cm.g） 

K：克分子消光系数；E1%cm：百分比吸光度的吸光系数；

注：不同蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量有差异，故标准管与测定管的蛋白质氨基酸组成应相似，以减小误差。

[器材]

(一)UV-9200紫外分光光度计

(二)50ml容量瓶

[试剂]

(一) 生理盐水

(二) 清蛋白(人或牛)纯晶

(三) 待测样本蛋白质：用双缩脲法测定蛋白质的样品用生理盐水稀释而成。



实验四 考马斯（Comessie)亮兰结合法测定蛋白质浓度

考马斯亮兰结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法。本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。

【原理】

考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250 的最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮兰G250-蛋白质定量测定的高敏性度。

在一定范围内，考马斯亮兰G250-蛋白质复合物呈青色。在595nm下，光密度与蛋白质 含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。

【操作】(常量法)

(一)标准曲线制备：

配制lmg／ml的标准蛋白溶液。制备系列稀释液，其浓度分别为1000μg／ml，500μg／ml， 250μg／ml，125μg／ml ，62.5μg／ml和31.25μg／ml。

按下表操作：


摇匀，室温静置3分钟。在第一管为对照管，在721型分光光度计于波长595nm处比色-读取光密度。以各管光密度为纵座标，各标准样品浓度(μg／ml)作为横座标作图得标准曲线。

(二)未知样品测定：

取血清0.25ml直接置于50ml容量瓶中，加生理盐水至刻度，摇匀。(此法样品稀释200倍)。

取试管二只，按下表操作：


摇匀，静置3分钟，在721型分光光度计亡波长595nm比色，读取光密度，查标准曲线，求得稀释样品蛋白质浓度。

【计算】

未知样品蛋白质浓度μg／ml＝稀释样品浓度×稀释倍数

【优缺点】

(—)操作简便、快速；检测灵敏；重复性好。

(二)显色迅速。约于2分钟内完成染料与蛋白质的结合。所现颜色至少在l小时内是稳定的。

(三)与改良Lowry氏法相比，干扰物质较少。

(四)当样品中存在较大量的十二烷磺酸钠(SDS)、TritonX-100等去垢剂时，显色反应会受到干扰。如样品缓冲液呈强碱性时也会影响显色，故必须预先处理样品。

(五)考马斯亮兰G250染液不宜久存，以1-2月为宜。

(六)微量法测定蛋白含量范围为1-10μg；常量法测以检测范围10-100／μg为宜。

【器材】

(一)试管l0支

(二)吸管10ml、l5ml、lml、O.1ml各1支。

（三）721分光光度法，普通比色杯4只。

【试剂】

(一)O.9％NaCl

(二)待测血清

(三)标准血清

(四)染液：考马斯亮兰G250 0.1克溶于0.5 m1 95%乙醇。再加入100m1 85％(W／V)磷酸。然后加蒸馏水定容到1000ml。[此时溶液为0.0l％考马斯亮兰G250／4.7％(W／V)／乙醇／8.5%(W／V)磷酸]。



实验五 BCA法测定蛋白质浓度

【原理】：

BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。

【操作】

标准曲线的绘制：取试管七支、编号，按下表操作：


【计算】

（一） 绘制标准曲线。

（二） 以测定管吸光度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。

（三） 再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。

【优缺点】

(一) 操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更加方便；

(二) 准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200μg/ml，微量BCA测定范围在0.5-10μg/ml。

(三) 经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量；

(四) 抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响。

【器材】

（一） 7220型分光光度计

（二） 恒温水浴箱

（三） 中试管7支

（四） 枪式移液管

【试剂】

1、 试剂A：1％BCA二钠盐 

2％无水碳酸钠 

0.16%酒石酸钠 

0.4％氢氧化钠 

0.95％碳酸氢钠 

混合调PH值至11.25。

2、 试剂B：4％硫酸铜。

3、 BCA工作液：试剂A 100ml ＋ 试剂B 2ml混合。

4、 蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定）

5、 待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。

此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。

总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多，但是，还没有一个完美的方法。在选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件决定。