色谱法分离酿酒过程中被修饰的麦芽蛋白

　　

生物通报道：酿造几乎是一个尽人皆知的简单过程，看过张艺谋《红高粱》的观众一定会对影片中所描绘的家庭式酿酒作坊中几十号人汗流浃背、忙碌穿梭的镜头记忆忧新。但家庭酿造与商业酿造有明显不同，前者中使用了麦精（malt extract）。工业生产中，酿酒师常常自己提取粮谷，以便能够对发芽（malting）过程进行控制。

发芽是酿酒的一个关键步骤。发芽过程中，谷粒被诱导发芽，释放淀粉转化为糖，蛋白转化为氨基酸所需要的酶。这些酶是酿造所必需的，待到谷粒开始抽芽时，酿酒师会将谷粒烘干，延长酶的活性。酿造开始时，酿酒师将发芽大麦浸没在热水中重新激活这些酶。于是淀粉开始转化为糖，准备被酵母转化为酒。

发芽过程中，谷粒中的蛋白也会受到影响，其中许多开始被出现的糖基糖化。某些富含脯氨酸残基的经过修饰的蛋白使啤酒变混浊，另一些蛋白在泡沫形成和安定（stabilisation，生物通编者译）中发挥重要作用。

大麦源性的脂质转运蛋白(lipid-transfer proteins，LTP)和蛋白Z，是啤酒中的主要蛋白，泡沫中10％的高分子物质都是这两种蛋白，剩下的大部分属于碳水化合物。大麦LTP1的修饰形式与泡沫形成有关，未经修饰的形式是无活性的。糖化蛋白Z提高了啤酒泡沫的稳定性。

因为这些后翻译修饰（post-translationally）的蛋白是酿造的核心，来自于有悠久酿酒历史的捷克的研究人员摸索从发芽大麦中鉴别这些蛋白的方法。国际科学院委员会大麦和啤酒花提取物研究中心的Josef Chmelik 和Janette Bobalova，利用单向聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和质谱技术，未能清晰指出蛋白的修饰过程。部分原因是，PAGE受速度限制，工业设备最好采用速度快的技术。

二人打算采用色谱法，这种方法将多孔性单片聚合体作为固定相，适合离子交换、倒相（reversed-phase）、亲合和疏水相互作用色谱(Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC)。将正规管柱（regular columns）的作用与和膜技术有关的对流传质（convective mass transfer）相结合，通过高通量方法，加快了分离速度。

对于修饰的大麦蛋白，研究人员采用阴离子交换盘状CIM柱和二极管阵列（diode array）探测法分离蛋白大麦芽水溶性提取物中的蛋白。根据盐梯度，洗脱液被分为三部分，第一部分对应于第0－1.0分钟内的尖峰，第二和第三部分分别对应第1.0－1.6和1.6－3.4分钟内的较宽一点的峰。

接下来，研究人员利用基质辅助激光解吸电离质谱（matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry ，MALDI MS）鉴别各部分的蛋白。MALDI MS能够探测蛋白的分子质量。第一部分中，质量为9991Da的蛋白对应的是被14-hydroxy-10,13-dioxo-7-heptadecenoic acid aspartate ester (CHDH)修饰的LTP1。进一步纯化得到的三个峰分别是添加了一个、两个或者三个由糖与蛋白中的赖氨酸残基通过酶拉德反应（Maillard reactions）形成的己糖修饰的LTP1。

第二部分含有己糖修饰的LTP2。第三部分含有未经修饰的和添加了己糖的蛋白Z的C末端，还含有带1－3个己糖残基的LTP2。三个部分中的其它蛋白还能根据分子质量被分离出来。

蛋白首先在溶液中被酶切，经过SDS-PAGE后在凝胶内被酶切。这种过程也用于鉴别第一部分中未被修饰的LTP1，第二和第三部分中不完整的未经修饰的蛋白。

Chmelik和Bobalova推测，LTP1是发芽过程中的一个理想的后翻译修饰标记物，可作为发芽质量参数，可被CIM色谱跟踪，在头一分钟的尖峰内。

CIM过程对于需要快速出结果的工业设备非常理想。分析过程总共只有15分钟，而双向电泳则需要2天。（生物通 小粥）