[方法学报告]最新小鼠实验操作工具

　　生物通报道：自20世纪初小鼠的遗传学研究从宠物农场进入哈佛大学的实验室只有短短一百年的历史，但是由于小鼠基因组与人类基因组高度同源、小鼠基因组改造手段非常成熟以及小鼠近交系、突变系和工具小鼠品系种类繁多，小鼠遗传学已成为发育生物学、功能基因组学和疾病机理研究的核心研究领域。

在本期的《Nature Genetics》上，分别来自霍华德休斯医学院犹他州大学，冷泉港实验室的研究人员报道了小鼠遗传学操作的最新工具。

原文摘要：
Nature Genetics 39, 914 - 921 (2007) 
Published online: 17 June 2007 | doi:10.1038/ng2045
Tissue-specific and reversible RNA interference in transgenic mice
[Abstract]

Nature Genetics 39, 922 - 930 (2007) 
Published online: 17 June 2007 | doi:10.1038/ng2060
Toward simpler and faster genome-wide mutagenesis in mice
[Abstract]

人是哺乳动物，而细菌、植物、酵母、线虫不是；小鼠也是哺乳动物，不像大猩猩、山羊、狐狸、雪貂、长颈鹿和豺，它能很好地适应实验室条件和遗传学需要。而且小鼠基因组与人类基因组高度同源、小鼠基因组改造手段非常成熟以及小鼠近交系、突变系和工具小鼠品系种类繁多，因此小鼠已成为发育生物学、功能基因组学和疾病机理研究的核心研究领域，小鼠也成为最重要的模式生物之一。

近年来，随着小鼠基因组序列测序的完成，不同小鼠近交系品系特异的微卫星标记或单核苷酸多态性不断被发现，小鼠生理生化表型分析手段和数据也越来越完善，这些前期工作导致了目前大规模的基因剔除计划、基因突变计划及构建和分析重组近交系计划的实施。这些计划可能构成未来10-20 年中生命科学和医学研究领域的最重要的内容之一。

小鼠遗传学研究开始于1902年，哈佛大学的Castle在当时孟德尔遗传学研究的影响下开始了小鼠遗传学研究，1909年Castle实验室的Little得到了第一个近交系小鼠——DBA 品系后，随后在Cold Spring HarborLaboratory 和The Jackson Laboratory 工作中陆续得到了C57BL/6、C3H、CBA 和BALB/c 等多种近交系小鼠，这些近交系构成了目前世界上使用最广泛的几种品系。在这一百年里人们已经建立了近400多个近交系，6 000 多个突变品系。

小鼠已成为了最适于基因组改造的模式动物。1982 年，Palmiter 和Brinster 首先制造了携带外源基因的新的小鼠品系——“转基因小鼠”。第一个转基因小鼠品系携带了可表达的大鼠生长激素的基因片断，过度的生长激素导致转基因小鼠的体型增大，第一次在整体动物水平证明了生长激素的功能。在Evans、Smithies 和Capecchi 等实验室的共同努力下，通过ES 细胞内DNA 同源重组的方法，科学家于1987 年得到了第一只基因剔除小鼠。基因剔除提供了研究在整体动物水平研究基因功能的“金标准”：即分析特定基因缺失后的功能障碍来推断基因的功能。1998 年，在Dolly 羊出生一年后，克隆小鼠也在夏威夷的实验室中诞生。由于在1990年启动人类基因组计划时小鼠就被列为五种核心模式生物之一，所以小鼠基因组计划是最早启动的非人基因组计划。到了2002 年，小鼠C57BL/6j 近交系基因组的研究相继取得了成果：5 月小鼠的16 号染色体基因图谱被首先被绘制出来，并发现其与人类的21 号染色体是高度同源的；8 月小鼠的全基因组图谱完成；12 月小鼠基因组测序基本完成。至此小鼠的研究进入了一个新阶段。

和小鼠的分子生物学研究同步的是小鼠的生理生化数据的积累。各种专门用于小鼠的代谢、心血管、呼吸、骨骼、血液、行为等生理功能检测仪器设备和方法在过去几十年中得到的迅速发展，比较医学的研究使得我们可以将小鼠的特定生理生化功能和人类进行比较分析。由于不同的小鼠近交系在许多上述指标上有明显的差异，因此，通过这些近交系基因组的多态性的连锁分析，可以建立特定功能表型在基因组上的定位，发现和确定表型与基因型之间的关系。从最早的简单分析不同近交系的分子多态性，进而采用微卫星标记，最新发展到单核苷酸多态性，在基因组中将一个特定功能或表型定位到1kb 将不再是梦想。

近年来，在基因组计划完成的基础上，通过化学诱变、DNA“基因陷阱”或转座子转座作用建立新的突变小鼠品系成为一种时尚，这种以新突变品系的病理表型为出发点，然后通过突变的染色体定位最终克隆突变基因的方法已经大大推动了疾病模型的研究，并在短期内提供了大量的新的小鼠品系。经典的小鼠遗传学家也找到了新的思路，他们正在建立上百种通过现有近交系杂交而形成的新的重组近交系。通过对这些新的近交系与母本近交系在生理生化表型和基因型的连锁比较，我们有望对一些复杂性状(如代谢过程)的调控作深入的遗传学分析，从而发现复杂疾病(包括糖尿病/ 肥胖症、高血压、免疫失调、及神经性疾病等)的发病机理机制。

从2005 年起，大规模开展基因剔除的研究计划分别在美国、欧盟和加拿大实施，第一期总投资达1 亿多美元。该计划的最终目标是要将小鼠的3万多个基因逐一进行基因剔除，建立基因剔除小鼠品系，从而分析基因的功能。可以预见，小鼠的突变品系，将在不远的将来达到4 到5 万个品系。

(遗传学筛选的的分类)

(作为模式动物的小鼠)

我国小鼠基因组改造相关工作研究起步晚、规模小，制约了我国功能基因组研究，相关疾病的动物模型研究也因此成为致病机理研究和生物医药研究开发的瓶颈。但近年来，在国家科技部、国家自然科学基金委员会、中国科学院及有关地方政府的资助下，我国科技工作者利用多种模式生物开展了生物技术、基因识别、基因表达谱、基因功能、个体发育、疾病发病机制及药理、毒理方面的研究，取得了一系列重要科研成果。

2001 年，科技部启动了“十五”攻关重点项目“国家遗传工程小鼠资源库的建立”，该项目于2005 年顺利结题。资源库建立了完善的转基因、基因剔除和化学诱变等小鼠基因组改造技术服务平台，三年多来已为国内外研发机构建立了遗传工程小鼠品系100 余种，其中基因剔除品系30 余种，这些小鼠品系中包括糖尿病、肥胖症、白内障、肢体残废、发育缺陷、心血管系统障碍等多种人类疾病的动物模型。

上海南方模式生物研究中心是于2000 年9 月由国家科技部“863”计划和上海市科委共同发起，并联合沪上多家从事相关研究的单位而组建的一家专业从事小鼠基因组改造技术研发的科研单位，是经上海市批准成立的自收自支的事业法人单位。中心主要任务是围绕国家目标，承担国家和地方科技项目，开展基础和应用基础研究。同时，为相关科研机构或企业提供模式生物技术服务。中心现已相继建立了140 多种转基因或基因剔除小鼠品系，涉及人类重大疾病10 余种，如白血病、肿瘤、乙型肝炎、糖尿病、骨质疏松症、心血管疾病、神经精神性疾病等。尤其令人可喜的是上海市政府为加强模式生物技术公共服务平台建设，支撑生物技术及生物医药产业发展，已投资近1.9亿元建设“上海实验动物资源公共服务平台”，其中包括大规模小鼠转基因和基因剔除技术平台和预算资金达1 000 万元的表型分析平台(小鼠医院)。该建设项目将计划于2007 年4 月建成投入使用。这无疑对项目总体目标的实现具有关键的硬件设施保障作用。

除此之外，军事医学科学院利用小鼠条件性基因剔除技术对骨关节炎致病基因的功能及其在发病机制中的作用进行了卓有成效的研究；中国医学科学院开展了细菌人工染色体克隆的小鼠转基因研究；复旦大学利用转座子插入技术，建立了一批突变小鼠模型。值得一提的是，2005 年，上海市科委立项300 个基因(总基因数的1%)的基因剔除计划，以期和国际上的小鼠研究同步。（来源自林兆宇等人的《小鼠的遗传学研究》）

《Nature Genetics》上这两篇文章，来自冷泉港实验室，纪念Sloan-Kettering癌症研究中心（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center ，MSKCC)的Scott Lowe等人报告了一种简单的转基因体系，能利用RNAi技术对内生性基因表达进行组织特异性的和可逆性的调控；另一篇文章中，来自犹他州大学霍德华休斯医学院的Mario Capecchi等人则发现Cre-loxP位点特异性重组能以相对高的频率产生大型germline删除，复制和染色体移位。

传统的小鼠模型主要是依靠转基因的过表达或者靶定的不可逆的基因突变，目前改造技术可以分为三类：一是通过物理或化学方法在小鼠生殖细胞DNA中随机诱导单个或多个碱基的突变形成，然后通过与野生型小鼠交配，将突变传给后代；二是通过ES 细胞或受精卵原核显微注射，在基因组中随机插入特定的碱基序列，转基因技术、“基因陷阱”技术及转座子技术可以归到此类；三是在基因组的特定位置插入或者删除特定的碱基序列，即基因定位突变，基因剔除(knock-out)和基因敲入(knock-in)属于此类。

但是，对于复杂生物，特别是包括人类在内的脊椎动物，整体动物研究层次才能彻底和全面的阐明基因的生理功能及其在疾病发生过程中的作用。胰岛素、瘦素和GLP1 等关键内分泌分子的靶器官包括肝脏、肌肉、大脑等多个组织，其分泌和代谢过程也涉及多器官和细胞类型，因此其作用的效果只有在整体动物水平才能得到系统说明。通过在特定组织剔除特定基因，分析其对整体动物生理生化过程的影响，才是最准确、也是最明确的基因功能研究手段。

在第一篇文章中，研究人员利用之前用于基因过表达中的四环素应答系统，发展了一种简单的转基因系统，可以可逆的调控基因表达。这些转基因小鼠含有一个四环素应答RNA合成酶II启动子，以及靶向肿瘤抑制因子Trp53的一个短发夹RNA（shRNA），当与现有的小鼠品系（表达常见的或组织特异性‘tet-on' 或‘tet-off'激活）杂交时，可以可逆的表达出shRNA。

研究人员在几个组织进行了Trp53的可逆敲除，并且在淋巴瘤（Trp53敲除启动其生长）中Trp53表达的恢复可以导致肿瘤的衰退。这种方法能不改变靶基因，完成体内基因的组织特异性和可逆的调控，可以广泛用于基础生物学和药物靶向确认的研究中。

在第二篇文章中，研究人员提出了一种实际操作性强的Cre-loxP和piggyBac转座子突变策略，可以用于大规模功能分析中对小鼠基因组编码序列和/或大量非编码区域进行系统突变。首先研究人员构建了loxP包含基因缺失（loss-of-function）等位基因（protocadherin , and 基因簇（Pcdha, Pcdhb and Pcdhg）），在合适的引导下，利用这些等位基因Cre-loxP位点特异性重组可以介导有效的体内trans-等位基因重组。]

这样将一个piggyBac转座子插入整合到loxP位点，并任意分布在小鼠基因组上，而且插入性功能失活和条件性rescue等位基因。
（生物通：张迪）