破冰行动：提速DNA电泳速度

　　生物通报道：来自宾夕法尼亚州费城杰佛逊医学院(Jefferson Medical College）外科系，以及Kimmel肿瘤中心（Kimmel Cancer Center）的研究人员申请到了一项新专利，这项专利也许未来某天会成为DNA分析过程中的关键技术，而且这一发现也可以应用于多个领域，比如法医鉴定，克隆或者生物恐怖（bioterrorism）。

这一专利由约翰霍普金斯医学院助理教授Jonathan Brody博士，以及其同事Scott Kern共同拥有，他们发明了一种新的技术，能将DNA分离技术，即DNA电泳的速度提高5倍，并降低实验成本。Brody博士表示，“仅仅通过提高分析的速度，它就能帮助我们每年节省数百万美元。” 

凝胶电泳是一大类技术，被科学工作者用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子。凝胶电泳通常用于分析用途，但也可以作为制备技术，在采用某些方法（如质谱(MS)、聚合酶链式反应(PCR)、克隆技术、DNA测序或者免疫印迹）检测之前部分提纯分子。 该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide， EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆技术操作。

琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好，其分辩力极高，甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的DNA，但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 

琼脂糖DNA是大多数分子生物学技术都要用到的实验手段，可谓是一种常规技术，其原理主要是电场中在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。

因此决定DNA电泳迁移率的因素包括：
1、 DNA的分子大小；

2、 琼脂糖浓度

一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%，分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%， DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。 

3、 DNA分子的构象 

DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有关，还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动最快，而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。 

4、 电源电压 

在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 

5、嵌入染料的存在 

荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15％。 

6、 离子强度影响 

电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶)，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 

对于天然的双链DNA，常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸]，TBE(Tris-硼酸和EDTA)，TPE(Tris-磷酸和EDTA)，一般配制成浓缩母液，储于室温。 

目前DNA电泳技术已经有30年未曾进行改进了，这项专利里，研究人员通过反复的实验，发现化合物硼酸锂（lithium boric acid）是用于DNA电泳分析的理想溶液。

上面提到，在电泳过程中，溶液传导电流从而使得带有负电荷的DNA分子实现分离。DNA被放置于凝胶中，小型的DNA移动速度要比大型DNA快。

研究人员发现，硼酸锂是一种比现有的使用了超过30年的溶液更好的缓冲剂，Brody说，“我们证明人们已经使用了30年错误的缓冲液，这些标准缓冲液更贵，也更慢”。

另外他也表示“传统方法需要一个半到两个小时的过程现在只需要10分钟。在某些时候它能将速度提高10倍。这是一个对科学有着广泛影响的发现。” 

“我们的发现不仅仅对肿瘤研究有用，同时还对神经科学、发育生物学以及每个需要DNA分析的领域有影响。”他说，“但是如同科学中的所有事物一样，这一技术还需要时间来得到验证——科学家们与其它普通人一样不喜欢改变。” 
（生物通：张迪）

附：
DNA电泳常见问题分析

（转载自丁香园）

 

 

 

 

 

问题	原因	解决办法
DNA带模糊	DNA降解	避免核酸酶污染
	电泳缓冲液陈旧	电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液
	所用电泳条件不合适	电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜ 30℃；巨大DNA链电泳， 温度应＜ 15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力
	DNA上样量过多	减少凝胶中DNA上样量
	DNA样含盐过高	电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐
	有蛋白污染	电泳前酚抽提去除蛋白
	DNA变性	电泳前勿加热，用 20mM NaCl缓冲液稀释DNA
不规则DNA带迁移	对于λ/Hind III片段cos位点复性	电泳前于 65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟
	电泳条件不合适	电泳电压不超过20V/cm；温度＜ 30℃；经常更换电泳缓冲液
	DNA变性	以 20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热
带弱或无DNA带	DNA的上样量不够	增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳 灵敏度稍高，上样量可适当降低
	DNA降解	避免DNA的核酸酶污染
	DNA走出凝胶	缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度
	对于EB染色的DNA，所用光源不合适	应用短波长（254nm）的紫外光源
DNA带缺失	小DNA带走出凝胶	缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度
	分子大小相近的DNA带不易分辨	增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度
	DNA 变性	电泳前请勿高温加热DNA链，以 20mM NaCl Buffer稀释DNA
	DNA链巨大	常规凝胶电泳不合适   在脉冲凝胶电泳上分析

　

Pancreatic Cancer Researcher Jonathan Robert Brody, Ph.D., Joins Surgery Department at Jefferson

Pancreatic cancer researcher Jonathan Robert Brody, Ph.D., has joined the Department of Surgery at Jefferson Medical College of Thomas Jefferson University as assistant professor of surgery. 

Prior to joining Jefferson, Dr. Brody served as an instructor at the Johns Hopkins University in advanced programs in biotechnology.

Currently, Dr. Brody is attempting to utilize the genetic understanding of pancreatic cancer to provide more rationale drug treatments. The studies include optimizing the common chemotherapeutic 5-fluorouracial and other drugs that can take advantage of mutations found in the majority of pancreatic cancers. The main goal of Dr. Brody’s laboratory is to understand the basic properties and defects of pancreatic cancer so he can translate this understanding to optimize the use of chemotherapeutics. 

“It is our hope that, in the near future, his research will provide critical information to clinicians about how to rationally treat pancreatic cancer patients based on the individual characteristics of each patient’s tumor,” said Charles J. Yeo, M.D., Samuel D. Gross professor and chair of surgery at Jefferson. 

While at Johns Hopkins, Dr. Brody took a postdoctoral position in oncology, training under the mentorship of Scott Kern, M.D., a world expert in the genetics of pancreatic cancer. With Dr. Kern, Dr. Brody revolutionized a basic molecular biology technique, DNA electrophoresis. Dr. Brody developed a low-molarity conductive media that is now being used worldwide to help speed the process time behind genetic based studies. Some predict this could speed up genetic research over five-fold. He also was Chief Graduate Student for the Department of Pathology at Johns Hopkins University in 2002. 

In 2003, Dr. Brody received the Excellence in Basic Science Research honor from the Pathology Department for the fourth and fifth Annual Young Investigator’s Day and the Experimental-Pathologist-Trainee of the Year from the American Investigative Society for Pathology. Dr. Brody is the author of nearly two dozen peer-reviewed publications. 

Dr. Brody earned a bachelor of arts degree in history from Skidmore College in Saratoga Springs, N.Y. in 1992 where he was a prestigious Filene Music Scholar for four years and a doctor of philosophy degree in pathobiology from The Johns Hopkins University School of Medicine in 2002. His thesis included cloning and defining a gene family linked to the process of prostatic and breast tumorigenesis.