北大博导梁宋平蛋白组学方法研究中国狼蛛毒素

研究蜘蛛毒素的一大局限是分子质量只有2－9 kDa的低分子量肽。梁宋平和来自湖南师范大学、北京大学的同事利用蛋白组学方法，鉴别中国狼蛛毒素成分。

　　

生物通报道：面对全部有毒液（venom）物种，人们因为对蜘蛛过分恐惧而对其额外心存介蒂。实际上虽然所有的4万多种蜘蛛都有毒腺，但只有少数几种对人体有害，而且从统计学上看，蜘蛛咬人事件极少发生。

毒液本身是由质量不同的分子组成的混合物，毒素（toxin）只是其中一小部分。依据毒素作用方式可将其分为neurotoxins（神经毒素，作用于神经）、cardiotoxins（心脏毒素，作用于心脏）、haemorrhagins（作用于血管）、血液毒素（haemotoxins，作用于血液）、nephrotoxins﹙肾脏致毒物质，作用于肾﹚、necrotoxins（作用于组织）和myotoxins（肌肉毒素，作用于肌肉）。这些多变的生物学特征有助于人们根据药理学活性发现新成分。

现代毒液研究通常采用蛋白组学，因为这些混合物中的靶标是肽和/或蛋白。然而，许多研究局限于分子质量只有2－9 kDa的低分子量肽。梁宋平和来自湖南师范大学、北京大学的同事认为造成肽段质量小的主要原因，一是毒液中高分子量蛋白含量较少，二是缺少蜘蛛基因组和cDNA文库。

梁与其同事研究毒液产量较大的中国狼蛛Chilobrachys jingzhao，以毒液中的肽和蛋白为靶标，寻找毒素和生物学活性成分。研究小组双面夹攻，最先进行凝胶过滤，将毒液中的分子按分子量以10kDa为标准分为两部分，然后利用各种分馏和质谱方法对各个组分进行分离提纯。

含量较少的蛋白片段首先利用双向电泳分离，然后利用胰岛素对各个蛋白点进行胶体内水解，利用基质辅助激光解析电离（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization ，MALDI）MS/MS和肽质量指纹谱（peptide mass fingerprinting）技术分析所有消化的物质，但没有得到任何匹配物。研究人员对此并不感到奇怪，因为原本也没有蜘蛛的蛋白质组/基因组数据库。

对于这些消化物质的后备技术是MALDI MS/MS和LIFT技术的de novo测序，其中涉及到高能量碰撞和电喷雾离子化 LC/MS/MS。结果鉴别出90个蛋白点中的47个，发现了酶、血蓝蛋白、毒素样蛋白和许多未知或假定蛋白。这些酶与许多途径有关，但没有发现在其它狼蛛的毒液中已经研究得较为透彻的毒素成分。

质量在10 kDa 以下、含量较多的肽段，经过阳离子交换色谱被分为8部分，研究人员对各个部分分别进行反相HPLC分离共得到97种片段，然后利用MALDI MS 和Edman测序法对逐个分析这97种片段，结果得到了大约120种已知肽段，其中60种已经过全部或部分测序，70％以上的质量在3－5 kDa之间，10％的分子质量在5－8 kDa 之间，与其它狼蛛毒液研究结果一致。

所有经过全部测序的肽段都含有3或4个二硫键，大约30％的C末端被胺化，翻译后修饰很少，一些肽段与之前在这种蜘蛛中发现的jinzhaotoxins相匹配。

研究小组进行了系统发生分析，以便进一步弄清这些经过全序列测序肽段的生物学功能。一组似乎是杀虫毒素；第二组由钠离子和钾离子通道抑制剂组成，这些也是这种蜘蛛的主要毒素成分。这些结果为进一步研究中国狼蛛提供了参考资料，有助于寻找药用的生物活性特异的肽段和蛋白。（生物通 小粥）

原文：Proteomics 2007, 7, 1892-1907: "Proteomic and peptidomic analysis of the venom from Chinese tarantula Chilobrachys jingzhao"

梁宋平简介：

                       

梁宋平，1970年毕业于北京大学生物学系，1983年获北京大学生物化学硕士学位（导师李建武教授），1986年获北大生物化学博士学位（导师张龙翔教授）。1986-1990年在美国波士顿大学进行博士后研究。1990年至现在在湖南师大学生命科学学院从事教学与科研工作，1992年晋升为教授，1994年被北京大学聘为兼职教授、博士生导师，已在北京大学招收了6届博士研究生，现为湖南师范大学副校长，教授、博士生导师，蛋白质化学与鱼类发育生物学教育部重点实验室主任，蛋白质化学及分子生物学湖南省重点实验室主任，教育部科学技术委员会学部委员，中国生物化学与分子生物学学会理事，湖南省生物化学与分子生物学学会理事长。近年来主持国家及省部级科研课题20余项，其中国家“973”项目1项、国家“863”计划项目2项,国家自然科学基金重大项目1项,面上项目6项,教育部、湖南省重点项目8项,主要从事蜘蛛肽类毒素结构与功能、蛋白质化学分析方法学、蛋白质组学等研究。先后在Toxicon、 Analytical Biochemistry、Protein Science、 Peptide J. Protein Chemistry、中国科学等刊物上发表论文60余篇,其中SCI收录30余篇。获国家专利2项，湖南省教育厅科技进步一等奖1项，国家教育部科技进步三等奖1项。曾获北京大学王式仪化学奖,国家教委科技进步一等奖(集体),1991年国家学位委员会授予“中国有突出贡献博士学位获得者”称号，1993年国家劳动人事部授予“有突出贡献中青年专家”称号，1998年评为全国模范教师。

附录:

一、目前主持的科研项目

1．虎纹捕鸟蛛毒素与三桥三片结构模式类多肽的蛋白质工程，国家863计划项目，90万元，1996-2001年

2．蛋白质组学系统分析方法学研究，国家自然科学基金重大目,60万元，1999-2002

3．五种虎纹捕鸟蛛毒素蛋白质结构与功能关系比较研究，国家自然科学基金面上 项目，18万元， 2001-2004年

4．虎纹捕鸟蛛毒素的系统生物化学研究，国家自然科学基金面上项目，14万元， 1998-2001年

5．青鱼胚胎发育过程蛋白质组学研究，教育部项目，2万元，2001-2003年

6．长穗双低两用核不育水稻蛋白质组学研究，省科技厅重点项目，10万，2001-2003

7．蛋白质组研究系统方法的建立与鼻咽癌蛋白质组研究，省科技厅重点项目， 31万，1999-2002年

8．鱼类胚胎发育调控过程的功能蛋白质组学研究，省教育厅重点项目，12万， 2001-2003

9．蜘蛛毒素镇痛活性肽HWAP-I 新药开发，北大未名集团横向课题，210万， 1999-2002。

二、近年来发表的主要学术论文  (*为联系作者)

1. Qin Shu,Renhuai Huang,Songping Liang*,Assignment of the disulfide bonds of huwentoxin-II by Edman degradation sequencing and stepwise thiol modification，Eur. J. Bochen. 2001，268, 2301-2307.

2. Jiang LI,Chen Tan,and Songping Liang*et al,Proteomic Detection of Changes in Protein Synthesis Induced by NGX6 Transfected in Human Nasopharyngeal Carcinoma Cells，J. of protoin chem. 2001,20 (3):265-271.

3. Yu Liu, Songping Liang*Chemical Carboxyl-Terminal Sequence Analysis of Peptides and Proteins Using Tribenzylsily Isothiocyanate，J. of prtoin chem. 2001,20(7):535-541.

4. 舒芹，吕善运，顾孝诚，梁宋平*，虎纹捕鸟蛛毒素ITWTX-II的H-NMR信号归属和二级结构分析，生物化学与生物物理学报， 2001，33(1)65-69。

5．陈平，梁宋平*，一种优化的MALDI-TOF质谱分析多肽C端序列方法，中国生物化学与分子生物学报，2001，17（5）656-660。

6．陈平，梁宋平*,虎纹捕鸟蛛毒素I中组氨酸残基的修饰与活性的关系，中国生物化学与分子生物学报，2001，17（5）642-646。

7．Songping Liang,Xiaolan Li,et al,Indentification of venom proteins of spider S.huwena on Two Dimensiond Electrophoresis Gel by N-Terminal Microsequencing and mass sp ectrometric peptide mapping ,Journal of protein chemistry 2000.19(3):225-229. 

8. Songping Liang,xiangding chen,et al,The presynaptic activity of huwentoxin-I,a neurotoxin from the venom of the Chinese bird spider Selenocosmia huwena Toxicon, 2000,38:1237-1246.

9. 王贤纯, 梁宋平*,构建同时携带HWTX-I和AAI活性位点的多肽嵌合体，生物化学与生物物理学报，2000，32（3）：275-280

10. 王贤纯, 梁宋平*, 虎纹捕鸟蛛毒素-I单残基突变体R20A-HWTX-I的化学合成与性质分析，生物工程学报，2000，16（4）：490-494。

11. 王贤纯, 梁宋平*,虎纹捕鸟蛛毒素-I突变体AIY-HWTX-I的固相合成和生物学活性分析，中国生物化学与分子生物学报，2000，16（3）：357-362。

12. 曹梦林, 梁宋平*虎纹捕鸟蛛粗毒双向凝胶电泳分析及部分蛋白质点的N端序列测定，中国生物化学与分子生物学报，2000，16（6）：755。

13. 陈平，梁宋平*,双向凝胶电泳银染蛋白质点的肽质谱指图分析，生物化学与生物物理学报，2000，32（4）：387-391。

14. Songping Liang,Qin shu ,et al,Oxidative folding of reduced and denatured huwen toxin-I,  Journal of Protein Chemistry, 1999.18(6)619-625

15. Qin shu, Songping Liang*,1999,Purification and characterization of huwetoxin-II,a Chinese bird spider S.huwena, J.Peptide Research,53:486-491

16.Feng Li，Songping Liang*,1999,Assignment of the three disulfide bonds of Selenocosmia huwena lectin-I from the venom of spider Selenocosmia huwena, Peptides. 20:1027-1034

17. Shanyun Lu, Songping Liang*,and Xiaocheng Gu,Three-dimentional Structure of Selenocosmia huwena lectin-I from the venom of the spider Selenocosmia huwena,J.Protein Chimistry, 1999,18(5):609-617

18. Shanyun Lu, Songping Liang*,Solution Structure of the major a-Amylase Inhibitor of the crop plant  Amaranth.J.Biol.Chem, 1999,274(29):20473-20478

19. 廖黔宁、梁宋平等,虎纹捕鸟蛛毒素-I28 肽类似物的化学合成与活性鉴定,中国生物化学与分子生物学报, 1999,15(5)755-761

20. 梁宋平、林莉,虎纹捕鸟蛛凝集素-I(SHL-I)的细胞凝集活性分析, 中国生物化学与分子生物学报, 1999,15(6)920-924

21. 莫碧兰、梁宋平等,蛋白质C端异硫氰酸法序列测定反应机理及进展  生物化学与生物物理进展, 1999,26(3)219-223

22. Songping Liang, Bilan Mo,Jiang Li,et al,.Solid-phase  synthesis  of huwentoxin-I and  its structure and bioactivity analysis. Science in China, 1997,40(5):449-457

23. Bilan Mo,Jiang Li,and Songping Liang*1997.A method for Preparation of Amino Acid Thiohydantoins from Free Amino Acids Actiateal by Acetylchloride for Development of Protein C-terminal Sequencing.   Analytical Biochemistry,249:207-211.

24.Bilan Mo,Jiang Li,and Songping Liang*.Chemical Carboxy-Terminal Sequence Analysis of peptides usig  Acetyl Isothiocyanate. Analyfical Biochemistry  1997,252:169-176.

25.Youxing Qu, Songping Liang* et al,1997.Proton Nuclear Magnetic Resonance Studies on huwen Toxin-I from the venoon of the spider selenocosmia huwena: 2. three dimentional structure in solution. Journal of Protein Chemistry.16(6):565-573.

26.梁宋平,夏赞贤等,1997, 虎纹捕鸟蛛毒素I的化学全合成及其结构与生理活性鉴定,中国科学(C辑), 27(5)391-397.

27.王迎、谢锦云、梁宋平,1997,大腹园蛛拖丝蛋白一级结构初步研究, 生物化学与生物物理学报,29(5):469-474.

28.Pei-ai,and Songping Liang*,Blockade of Neuromuscular Transmission by HWTX-I Purified from  the Venom of the Chinese Bird Spider S. Huwena. Toxicon. 1996, 34(9):965-972.

29.Songping Liang ,Pan xin ,A lectin-like peptide isolated fron the venom of the Chinese bird spider Selenocosmia huwena, Toxicon. 1995,33(7):875-882.

30.Youxin Qu, Songping Liang*,1995.Proton Nuclear Magnetic Resonsnce studies on Huwenetoxin-I from the  Venom of the Spider Selenocosmia huwena: Sequence-Specific H-NMR Assignments.  Journal of Protein Chemistry. 14(7):549-557.

31.Songping Liang,Dongyi Zhang,Propeties and Amino Acid Sequence  of  Huwen toxin-I, a Neurotoxin purified from the venom of the bird spider Selenocsmia huwena. Toxicon. 1993 3(8):969-978.