川大张义正教授大熊猫基因克隆研究新进展

　　

生物通报道：大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）是我们国特有的珍稀濒危动物，具有极高的科研和观赏价值。四川大学生命科学学院的张义正教授的研究组在大熊猫基因克隆研究方面取得了一些重要的进展。

 

据了解，除了栖息地的破坏和减少外，低下受孕率是导致大熊猫濒危的重要因素之一，而受孕率高低与精卵融合能力直接相关。

 

之前的研究已经知道，CD9基因在精卵质膜相互作用中具有重要作用，属于4次跨膜蛋白超家族的成员。CD9的缺失小鼠的卵细胞不能与精子融合，而将小鼠CD9 mRNA注射入小鼠卵细胞后，能够恢复小鼠精卵融合的活性。

 

为弄清大熊猫受孕率低是否与CD9基因相关，张教授的研究组对大熊猫CD9基因的结构及其表达产物生物学活性进行了研究。

 

研究组利用RT-PCR从大熊猫的卵巢组织克隆到大熊猫CD9(gpCD9)基因，CD9基因的编码去全长681 bp，编码226个氨基酸残基，分子量约25kDa。大熊猫的CD9氨基酸序列与其他动物相比，具有较高的保守性，其中与猫CD9同源性为91％，与人CD9的同源性为89％，，与小鼠的CD9同源性为87％。

 

为检测大熊猫CD9基因在精卵融合过程中的功能区，他们还利用PCR将大熊猫CD9基因大胞外环进行定点突变，使其3肽序列TVT(173～75)突变为AAA。突变位点经测序证实，与鱼鳍结果相符。研究组利用PCR方法分别从大熊猫CD9基因及其突变型基因和小鼠CD9基因扩增到大胞外环（large extracellular loop, LEL）编码序列，并分别命名为gpLEL、gpLELm、mLEL——它们均编码83个氨基酸残基，分子量约为9.5kDa。

 

接着，研究组将3个大胞外环序列分别克隆到原核表达在途pET32a，成功构建了3个表达质粒，命名为pET-gpLEL、pET-gpLELm、pET-mLEL。将它们分别转化大肠杆菌BL21(DE3),对表达的3个融合蛋白进行SDS-PAGE分析，并获得了1条28kDa的特异蛋白带——这与推测的蛋白质大小相符。然后，他们利用HPLC（高效液相色谱）对融合蛋白进行纯化，最终获得了3种纯化蛋白质。

 

另外，研究组还从6到8周龄的雌鼠获得超排的卵细胞；从10－12周龄的雄鼠体内获得精子。然后，将去透明带卵细胞先与3忠蛋白质分别共同温育30分钟后，将获能精子进行体外受精。

 

实验结果表明，gpLEL和mLEL严重抑制小鼠受精，而gpLELm则对受精的影响较小。这些发现意味着大熊猫CD9与其他哺乳动物CD9一样，都能有效地参与精卵质膜融合过程，而且大熊猫CD9与小鼠、人CD9基因具有相似的功能区域。此外，研究还表明大胞外环173－175的3个氨基酸残基在精卵质膜融合过程中起着重要的作用。

 

这些研究将有助于进一步了解大熊猫的生殖秘密，并可能促进大熊猫的保育工作，最终可能提高大熊猫的受孕能力。

 

张义正教授，1970年6月毕业于四川大学生物学系后留校，从事微生物学的教学和科研工作至1982年2月。1982年3月-1987年12月他在美国密歇根州立大学微生物学系学习，获博士学位。1988年元月至今在四川大学生命科学学院生物工程学系从事遗传学和生物技术等领域教学和科研工作。1988年5月聘为副教授，1992年6月评聘为教授，1993年11月经国务院学位委员会批准为遗传学博士点指导教师，1997年5月任国务院学位委员会第四届学科评议组成员。1994年4月四川大学与成都科技大学合并，任副校长至今。

张教授的主要研究方向，为微生物学，分子遗传学和基因工程。主要研究内容包括：微生物降解木质纤维素的分子机理研究；参与木质纤维素降解的木质素过氧化物酶、纤维素酶和半纤维素酶基因的克隆；用于几丁质降解的几丁酶基因和皮革脱毛的蛋白酶基因的克隆；启动子探针型系列载体的构建和多种微生物基因启动子的分离；黑曲霉高效表达系统的建立；高等植物（如油菜、水稻和红薯等）基因启动子的分离和表达载体的构建；红薯块根储藏蛋白基因的克隆；大熊猫、小熊猫和浣熊等珍惜动物神经营养生长因子基因的克隆；大熊猫和小熊猫等珍惜动物性别决定因子基因的克隆 。（生物通雪花）

附 近年主要发表论文（部分）：

在国内外重要刊物上发表学术论文70多篇，参加国际国内学术会议论文60多篇。论文主要发表在核心期刊以上水平的杂志上，论文被引频次100次以上。

1.  Use of synthetic oligonucleotide probes for identification ligninase cDNA clones. Meth. Enzymol. 161: 228-237, 1988.

2.  Cloning of several lignin perooxidase(LIP)-encoding genes: sequence analysis of the LIP6 gene from the white-rot basidiomycete, Phanerochaete chrysosporium. Gene 97: 191-198, 1991.

3.  酿酒酵母基因启动子的分离和鉴定。真菌学报14：57-63，1995。

4.  枯草杆菌内切葡聚糖酶基因的克隆与表达。生物工程学报12：87-91，1996。

5.  枯草杆菌中性蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达。生物工程学报13：304-308，1997。

6.  应用RAPD技术对大熊猫分类地位的探讨。兽类学报17（3）：161-164，1997。

7.        小熊猫脑源性神经营养因子(BDNF)基因的克隆与序列分析 。四川大学学报(自然科学版) 34（3）：367-370，1997。

8.        环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因的克隆。生物工程学报14：29-33，1998。

9.        环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因在大肠杆菌中的表达。生物化学与生物物理学报30：352-356，1998。

10.    马来熊脑源性神经营养因子基因编码区的克隆与序列分析 。动物学报 44（1）：102-106，1998。