[技术特写]纵观RNA纯化技术三十年

[技术特写]纵观RNA纯化技术三十年

　　

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“新技术发展赋予了RNA纯化技术更高的质量，更快的速度和更好的有效性”

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一些基础性的实验室技术，比如Northern blot分析，RNA保护性实验（RNA protection assays），原位杂交（in situ hybridization）和逆转录PCR（RT-PCR）等都需要高质量，高纯度的RNA样品。但是做过RNA纯化的人都知道，准备这些样品往往耗时耗力，这主要是因为那些“可恶”的即稳定又到处可见的RNAses很容易就把这些样品降解了。

以前这些RNA制备的工作往往都需要特定的实验室，特殊的仪器，和一些专门从事这一方面的研究人员十分小心的操作完成，但是随着生物技术的发展，许多RNA纯化产品和操作手册的出现，研究人员也逐渐可以轻松解决RNA纯化问题，专注于自己的科学研究内容了，即使是缺乏RNA操作专家的实验室也能放心着手基因表达分析的研究了。

RNA提取的第一步是细胞裂解，这一步简而言之就是要使组成细胞膜的蛋白变性。

1979年John Chirgwin和他的同事发明了一种可以不改变核苷酸而破裂细胞膜的方法：先将组织在异硫氰酸胍（Guanidine Thiocyanate）——一种蛋白变性剂和b-巯基乙醇——一种还原剂中混合均匀，然后通过乙醇抽提或者氯化铯梯度超速离心就可以分离纯化细胞中的RNA了。这种技术是第一种可以特异性分离RNA的方法，但是存在许多缺点，比如这种技术耗时长，低效率，也存在一定的危险性和不一致性。

1987年Piotr Chomczynski和Nicoletta Sacchi对这一技术进行了改良，他们通过将异硫氰酸胍和酚/氯仿（phenol-chloroform）结合起来，将抽提的步骤缩短到了一步，这一修改至少带来了两个改进：第一，减少了RNA分离的时间，增加收集到的样品数，二来就是减少了RNA的损失，增大了样品选择范围，允许研究人员从更少量样品数中纯化RNA。然而尽管优化了纯化步骤，但是这种方法仍然有一些不足之处，比如说，超速离心不仅需要昂贵的设施，而且也经常导致RNA凝集，形成pellets，不利于悬浮。而且粗糙的有机溶剂也会引起样品中RNA断裂，造成损失。

在进一步完善这些方法的道路上，许多生物技术公司也贡献不小，比如著名的RNA公司Ambion（现RNA部门已被ABI收购），旗下的ToTALLY RNA™总RNA提取试剂盒就是基于Chomczynski和Sacchi的异硫氰酸胍，酚:氯仿方法，这个试剂盒包含了这一方法所需的除异丙醇以外的所有试剂。通过Ambion的试剂整合和流水线操作，ToTALLY RNA™试剂盒可以从来源广泛（包括植物组织到细菌在内的许多来源），样品量较低（10g组织或者10⁹培养细胞）的条件下纯化得到高质量RNA。

另外一个倍受关注的，改进了RNA分离提取方法的生物技术公司就是GE（原Amersham Biosciences）公司了，虽然GE采用的也是异硫氰酸胍方法，吸取了其中的优点，但是他们的RNA提取试剂盒利用氯化锂和三氟醋酸铯（cesium trifluoroacetate，CsTFA）进行选择性沉淀和密度离心，这样就不用依赖于有机溶剂，可以用普通的离心机在60分钟内，从少至25mg或者10⁶-10⁸细胞样品中分离得到RNA，而且CsTFA离心对于避免RNAses降解作用也有更高的保护作用。

近期GE又推出了一款新产品：RNAspin总RNA分离试剂盒，这一系列试剂盒采用了最新的硅胶膜离心柱，配合独有的预过滤器和柱上 DNaseI 酶解等技术， 能确保每次实验都能得到所需要的产率、纯度和重复性，这一试剂盒就像是特别为敏感的下游应用，例如定量RT-PCR 及微阵列分析而设计的一个RNA纯化分离试剂盒。

除此之外，Maxim Biotech则提供了一种能从任何组织或者细胞类型的样品中提取RNA的试剂盒：Gstract™总RNA分离试剂盒，这一试剂盒有一个独特的附加提取步骤，能减少DNA和其它污染物的含量，因此得到的RNA可以直接用于一些譬如RT-PCR的实验。还有PGC Scientifics公司的RNA NOW^®，一种60分钟内从10⁷细胞或者100mg组织中分离RNA的产品，这一试剂盒最大的特点就是生物可降解性，是一种不需苯酚的环保型试剂。另外Qbiogene Inc也推出了一种总RNA提取试剂盒：Safekit™，可以从10-100mg组织样品中得到100ug总RNA。（生物通：张迪）