构建最理想的siRNA

构建最理想的siRNA

　　

siRNA设计系列文章：

siRNA 的设计(之一)

RNAi：制备siRNAs的5种方法——如何选择最适合你的方法

在哺乳动物细胞中进行RNA干扰:设计，实验和分析siRNA效应

利用试剂盒，自己制备siRNAs或者dsRNA

PCR产物直接转染细胞并转录siRNA诱导RNAi

用RNase III制备siRNA库来诱发RNAi

　如何设计出理想有效的siRNA是RNAi研究及RNAi技术应用的一个重要方面，甚至可以说是决定性的一个方面，然而一直以来，想要获得目的基因最佳敲除效果进行siRNA序列设计是一件吃力不讨好的事，但是随着RNA干扰技术的进步，以及各家生物技术公司的重点关注，一些siRNA试剂盒也呈现出了有针对性，系统化过程等简便siRNA设计的特点。

比如Ambion（RNA部门已被ABI收购）的Silencer™试剂盒等能够通过PCR获得siRNAs序列簇，并且一旦这些序列被扩增出来，PCR cassettes就可以直接转染进细胞系中，这样就能判断这些siRNA(s)中哪一个能获得最好的敲除效果。

这种技术的原理主要在于siRNA表达框（siRNA expression cassettes，SECs)，这是一段PCR产物，包含启动子、发夹结构的siRNA模版（hairpin siRNA template）和终止序列，当PCR产物转染到细胞后，发夹结构的siRNA模版被转录，得到的发夹siRNA被加工并诱导特异的基因表达沉默。

siRNA表达载体需要经过克隆和测序，这可能需要1—2周的时间，如果已知siRNA有效，这番克隆是值得的，因为只有载体上的siRNA才能持续表达，但是如果有很多siRNA筛选，这么艰苦的克隆和测序就非常费时费力了。siRNA表达载体由于Size比较大，转染效率不高，而且细胞必须在有抗生素压力的条件下培养来维持siRNA的表达，对于一些敏感细胞就无能为力了。而SECs能够在一天的时间内制备，转染方便高效，无需抗生素筛选，无需克隆和测序，能有效的节约时间，因而成为一种非常有效的筛选siRNA的工具，或者是鉴定不同启动子和不同的siRNA序列之间最佳搭配的筛选工具。应该说SECs是siRNA表达载体的完美补充，通过在SECs两端添加酶切位点，在实验中找到的高效SECs就能够立即被克隆到质粒中，从而得到siRNA表达载体，从而进行稳定和长时间的RNAi研究。

这种方式虽然对于siRNAs筛选以及细胞系转染十分方便，但是如果研究人员希望进行体内siRNA传送，那么在确认了最佳的siRNA序列之后还要选择一个病毒传递系统。目前有几种病毒系统，都具有高转染率。如何选择这些系统主要是看各人的实验需要，腺病毒不能整合到细胞基因组中去，但是能进行瞬时表达，而慢病毒（Lentiviruses）和逆转录病毒（retroviruses）则能整合到基因组中去，进行稳定表达。另外腺病毒和慢病毒系统可以用于感染分裂细胞和非分裂细胞，但逆转录病毒系统只能用于感染分裂细胞。
（生物通：万纹）