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构建最理想的siRNA
【字体: 大 中 小 】 时间:2007年01月19日 来源:生物通
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构建最理想的siRNA
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如何设计出理想有效的siRNA是RNAi研究及RNAi技术应用的一个重要方面,甚至可以说是决定性的一个方面,然而一直以来,想要获得目的基因最佳敲除效果进行siRNA序列设计是一件吃力不讨好的事,但是随着RNA干扰技术的进步,以及各家生物技术公司的重点关注,一些siRNA试剂盒也呈现出了有针对性,系统化过程等简便siRNA设计的特点。
比如Ambion(RNA部门已被ABI收购)的Silencer™试剂盒等能够通过PCR获得siRNAs序列簇,并且一旦这些序列被扩增出来,PCR cassettes就可以直接转染进细胞系中,这样就能判断这些siRNA(s)中哪一个能获得最好的敲除效果。
这种技术的原理主要在于siRNA表达框(siRNA expression cassettes,SECs),这是一段PCR产物,包含启动子、发夹结构的siRNA模版(hairpin siRNA template)和终止序列,当PCR产物转染到细胞后,发夹结构的siRNA模版被转录,得到的发夹siRNA被加工并诱导特异的基因表达沉默。
siRNA表达载体需要经过克隆和测序,这可能需要1—2周的时间,如果已知siRNA有效,这番克隆是值得的,因为只有载体上的siRNA才能持续表达,但是如果有很多siRNA筛选,这么艰苦的克隆和测序就非常费时费力了。siRNA表达载体由于Size比较大,转染效率不高,而且细胞必须在有抗生素压力的条件下培养来维持siRNA的表达,对于一些敏感细胞就无能为力了。而SECs能够在一天的时间内制备,转染方便高效,无需抗生素筛选,无需克隆和测序,能有效的节约时间,因而成为一种非常有效的筛选siRNA的工具,或者是鉴定不同启动子和不同的siRNA序列之间最佳搭配的筛选工具。应该说SECs是siRNA表达载体的完美补充,通过在SECs两端添加酶切位点,在实验中找到的高效SECs就能够立即被克隆到质粒中,从而得到siRNA表达载体,从而进行稳定和长时间的RNAi研究。
这种方式虽然对于siRNAs筛选以及细胞系转染十分方便,但是如果研究人员希望进行体内siRNA传送,那么在确认了最佳的siRNA序列之后还要选择一个病毒传递系统。目前有几种病毒系统,都具有高转染率。如何选择这些系统主要是看各人的实验需要,腺病毒不能整合到细胞基因组中去,但是能进行瞬时表达,而慢病毒(Lentiviruses)和逆转录病毒(retroviruses)则能整合到基因组中去,进行稳定表达。另外腺病毒和慢病毒系统可以用于感染分裂细胞和非分裂细胞,但逆转录病毒系统只能用于感染分裂细胞。
(生物通:万纹)