蛋白质组研究新方法 检测血浆各种浓度蛋白

　　

生物通编译：免疫亲合筛选（Immunoaffinity depletion，生物通网站注释）和化学分离方法（chemical fractionation，生物通网站注释）使血浆中的蛋白组分分析范围更为宽广。这种新方法为将来炎症反应的机制研究打下基础。

 

从蛋白组分的角度来看，人类血浆可以说是能反应肌体任意时刻的健康状况的最完整的蛋白源，肌体中的绝大多数细胞都与血液有着直接或间接的联系，所有生理状况改变或者疾病所涉及的蛋白将会在血浆中出现。难题是如何在各种蛋白、氨基酸和其它成分组成的混合物中对这些蛋白进行检测。

 

血浆中各种蛋白浓度的动态范围很广：据不同估计，其中最高丰度和最低丰度的蛋白质浓度相差10¹⁰ 到 10¹²倍。这就意味着一些低丰度蛋白会“湮没”在白蛋白等高丰度蛋白中而逃过蛋白组学检测。解决方案之一包括初步分离去除高丰度蛋白以及多级分离为不同的组别，从而逐个分析。

 

目前，美国的研究人员开发出一种新的方法，可以对血浆蛋白中浓度范围相差很大的成分进行分析。这个针对外伤引起的宿主响应和炎症反应的大规模协作研究项目的报告发表在Mol. Cell. Proteomics上，涉及47位研究成员和14位作者。

 

研究小组研究来自严重外伤病人的血浆，寻找与炎症反应和机体响应对免疫系统攻击有关的蛋白。在开始的实验中，利用混合亲合层析除去占总蛋白95－96％的12种高丰度血浆蛋白。最后只有5.6％的总蛋白留在血浆中。

 

接下来，将已经分离过的血浆分为两份，分别经过两种加工程序，以富集含有半胱氨酸多肽或含N－末端糖基的多肽。首先，一部份用胰岛素消化并过硫醇亲合层析柱（thiol affinity resin，生物通网站注释），含半胱氨酸的多肽被硫醇亲合层析柱捕获；并被洗脱、还原、烷基化。没有被亲和柱吸附的不含半胱氨酸的多肽部分也被收集。

 

另一部分分离过的血浆用高碘酸盐（periodate，生物通网站注释）进行氧化，使糖蛋白中丙三醇临近碳原子上的羟基转化为醛基。糖蛋白经过酰肼树脂（hydrazide resin，生物通网站注释）被捕获，除去非糖蛋白后，用胰岛素消化结合在树脂上的糖蛋白，收集得到N－糖肽，以及没有被吸附的非糖肽。

 

将所有得到的4种肽段片断进行强阳离子交换层析，各自分段为30个部分，接着进行 LC/MS/MS电离子质谱分析和HPLC液相色谱进一步分离。总共鉴别出22，267个肽段，被用来鉴别3654种蛋白，鉴别标准比HUPO推荐的方法更为严谨。其中1494种蛋白的鉴别来源于2个或以上的肽段，不过所有的鉴别都是高置信度的，即使是那些仅靠一个肽段鉴别的蛋白。这种方法检测蛋白的动态范围大于10⁷

 

被探测得到的蛋白包括许多中、低丰度的细胞因子、细胞因子受体、细胞分化抗原和其他一些涉及炎症反应和免疫反应的蛋白。总之，这种方案使得建立外伤患者蛋白质参考数据库成为可能。

 

然而这还不足够。为了利用某些低丰度的成分作为炎症反应或者免疫系统攻击的生物标志物，这种定性的方法需要进一步改进为相对定量的方法，从而可以检测特定蛋白浓度的变化。研究小组宣称其方法可以修正从而具有自动定量分析能力，比如联合同位素标记和准确的等量标签（mass tags，一种可对多样品（譬如蛋白质）同时进行定量分析的标记技术，生物通网站注释）。生物通记者宗敏