水稻花色苷含量的遗传研究进展

　　花色苷属类黄酮化合物，不但表现优异的色泽，而且还具有抗氧化或抗脂质氧化活性、抗发炎活性、抗发厥活性、降低血清胆固醇和血清脂质、抑制癌细胞和抗癌等生理功能。孙玲  等研究表明，黑米稻花色苷含量越高，清除超氧阴离子自由基的能力愈强，黑米的抗氧化特性与其花色苷含量呈显著正相关。Koide  等研究表明，红米稻花色苷水解物能明显抑制肿瘤细胞的生长。Hu  等试验表明，黑米稻花色苷具有显著的抗氧化、清除自由基、抗发炎能力，能显著预防由活性氧诱导的  DNA  超螺旋链分裂以及抑制人体低密度脂蛋白的氧化修饰。Ichikawa  等研究报道，紫黑米稻花色苷的抗氧化活性是同浓度对照抗氧化剂水溶性生育酚(Trolox)的10～25倍，主要清除超氧化物自由基。Nam  等研究发现，紫黑米稻皮层70％乙醇浸提液具有抗氧化、抗突变及抗癌活性。Itani  等研究发现，水稻多酚含量与其抗氧化能力相关，并且紫黑米稻主要的活性物质为花色苷。Ryu  等利用水稻甲醇浸提液对二苯代苦味酰(DPPH)进行抗氧化及清除试验结果表明，水稻甲醇浸提液对  DPPH  的清除效果与水稻花色苷含量呈正相关。Toyokuni  等研究结果表明，水稻矢车菊花色素-3-O-β-D-葡萄糖苷对小鼠肾脂质过氧化反应具有保护作用。  



　　近年来，随着环境恶化和人们生活方式的变化，尤其是膳食方式的变化，各种现代慢性疾病如动脉粥样硬化、高血脂、冠心病和癌症等的发病率不断高攀，处于亚健康状态的人群比例越来越大，全国约有45％的人处于亚健康状态。这不仅给社会及国家的医疗体系带来巨大的压力，也给人们带来不可言喻的痛苦，人们对食品功能性和安全性的要求越来越高。色稻是指植株(叶、茎)、谷粒(颖壳、糙米)带有色泽的水稻，而本文则着重阐述糙米(颖果)带有色泽的水稻。大量研究结果表明，色稻不仅富含花色苷，还含有一般水稻品种中缺乏的  VE、胡萝卜素、黄酮、生物碱、强心甙、木酚素、甾醇等生物活性物质和铁、硒、锌、钙等矿质元素。花色苷作为水稻重要的生物活性物质，已成为当前功能性食品开发研究的热点之一。因此，从现有色稻种质资源中充分发掘花色苷含量丰富的材料，广泛开展其遗传规律和基因定位研究的同时，积极培育优质高花色苷含量水稻品种，这不仅将为高花色苷含量的水稻育种和相关基因克隆提供理论依据，而且可以满足人们对功能性水稻的消费需求，有利于开拓国内外稻米市场，对食品、医药和化妆品行业都具有重要意义。  



1  水稻花色苷的生物合成及其组成成分  



1.1  水稻花色苷的生物合成  



　　花色苷是18种天然存在的花色素的糖苷化合物，为2-苯基苯并芘或黄烊盐离子的多羟基以及多甲氧基衍生物，其中形成颜色的成分是花色素。根据羟基位置和数目，花色苷主要分为3种类型：一为天竺葵花色素苷，颜色为鲜红色；二为矢车菊花色素苷，颜色为西洋红；三为飞燕草花色素苷，颜色为蓝和紫，并且随侧酚环中羟基数目的增加，花色苷颜色由红向蓝色方向发展。花色苷的生物合成包括近20步化学反应，大约涉及到15个结构基因和2类(myb  和  myc  型)调节基因。花色苷生物合成的关键步骤如图1所示。色稻是由于花色苷在水稻果皮、种皮或糊粉层中沉淀积累，从而使  糙米呈现绿、黄、褐、红、红褐、紫红、红黑和乌黑等颜色，其中以黑米稻和红米稻占多数。  



1.2  水稻花色苷的组成成分  



　　赵则胜利用纸层析和硅胶  G  薄层层析法，对黑米稻品种上农黑糯和乌贡一号所含的花色苷进行分析，结果表明其花色苷由矢车菊花色素-3-葡萄糖苷和飞燕草花色素葡萄糖苷组成。Hu  等对籼型黑米稻花色苷研究表明，其为矢车菊花色素-3-葡萄糖苷和芍药花色素-3-葡萄糖苷。徐杰等利用柱层析和纸层析法，研究发现贵州黑糯米稻的花色苷成分为矢车菊花色素-3-葡萄糖苷和矢车菊花色素-3-双葡萄糖苷。Ryu  等通过对10个色稻品种分析，认为水稻花色苷主要包括矢车菊花色素-3-葡萄糖苷和芍药花色素-3-葡萄糖苷。苏金为对黑米稻品种岩黑稻和岩紫糯色素分离鉴定认为，其主要成分为矢车菊花色素-3-葡萄糖苷和矢车菊花色素-3-鼠李糖苷。  



　　张晴等通过测定黑米色素的吸收光谱，认为黑米稻花色苷主要为3'甲花翠素-3-O-葡萄糖苷。Ichikawa  等利用毛细管电泳及聚丙烯吡咯烷酮柱层析，认为紫黑米稻花色苷为矢车菊花色素-3-O-β-D-葡萄糖苷。Cho  等研究报道，黑米稻品种  Suwon415  的花色苷为矢车菊花色素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。Giaccherini  等报道，黑米稻品种  Venere  花色苷的主要组分为矢车菊花色素-3-O-葡萄糖苷。  



　　Choi  等对13份不同水稻种质资源的花色苷分析表明，矢车菊花色素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和芍药花色素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为其主要成分。钟丽玉等用纸层析、紫外可见光扫描及气相色谱结合的方法，对黑米稻品种全黑粳分析表明，其花色苷由矢车菊花色素-3-鼠李糖苷和芍药花色素-3-阿拉伯糖苷等5种花色苷组成。Terahara  等通过对香红米稻花色苷进行高效液相色谱(HPLC)分析，鉴定其组分为矢车菊花色素-3,5-二葡萄糖苷、矢车菊花色素-3-槐二糖苷、矢车菊花色素-3-葡萄糖苷、矢车菊花色素-3-芸香糖苷和芍药花色素-3-葡萄糖苷、芍药花色素-3-芸香糖苷。  



2  水稻花色苷含量的影响因素  



2.1  水稻花色苷含量的遗传影响  



　　水稻子粒主要由稻壳和糙米两部分组成，而糙米又包括果皮、种皮、珠心层、糊粉层、胚乳和胚等。张名位等研究表明黑米剥皮2  min，所得花色苷约占全米花色苷总量的65％～70％；剥皮4  min，所得米皮累计重不到15％，而花色苷占98％以上。因此，黑米中花色苷分布是从糙米粒表面至内部急剧递减的，主要集中在重量不到10％的外表皮部分。  



　　水稻花色苷含量不仅在子粒不同部位间有显著的差异，而且在水稻不同品种类型间也有显著差异。Koh  等测定4种不同色稻种质资源的花色苷含量结果发现，褐米稻及红褐米稻的花色苷含量为1.63～17.62  μg/g，红米稻的花色苷含量为3.56～11.10  μg/g，紫米稻的花色苷含量为28.11～401.22  μg/g，而黑米稻的花色苷含量为3665.98  μ/g。Phoka  等测定结果表明，浅黄稻  KDML105  的花色苷含量为  1.25  μ/g，浅黄稻  BW4  的花色苷含量为8.07  μg/g，红黑稻  JHN  的花色苷含量为594.96  μg/g。张名位等选用黑粘110、黑丰糯、龙锦1号、秦稻2号和白米稻品种丰澳粘，测定其花色苷含量，结果发现这5份水稻种质资源的花色苷含量大小顺序为：龙锦1号＞黑丰糯＞秦稻1号＞黑粘110＞丰澳粘。张晴等测定2份水稻种质资源的花色苷含量结果，黑米稻乌贡的花色苷含量为842  μg/g，香血糯为2844  μg/g。Ryu  等测定10份黑米稻种质资源的花色苷含量结果表明，花色苷含量变异范围为0～4930  μg/g，其中  Suwon  415品种的矢车菊花色素-3-葡萄糖苷含量为  4700  μg/g。Ryu  等通过测定591份水稻种质资源的花色苷含量，发现水稻花色苷含量为0～4751  μg/g，其中矢车菊花色素-3-葡萄糖苷含量为0～4519  μg/g，芍药花色素-3-葡萄糖苷含量为0～427  μg/g。  



2.2  水稻花色苷含量的环境影响  



　　水稻花色苷含量不仅受品种本身的遗传因素控制，同时也受生态环境的影响。张名位等分析不同播种收获期的黑米稻品种的花色苷含量表明，黑米稻花色苷含量与其抽穗后30  d  的日均气温、日均光照时数和日均相对湿度密切相关，其中与日均温度和日均日照时数呈显著负相关，与日均相对湿度呈显著正相关。贺浩华等选用5个黑米稻品种分期播种，分析气候因子对水稻花色苷含量的影响，结果表明不同种植季节影响水稻花色苷含量的主要是温度。早稻和中稻生育期平均气温较高，高温使子粒灌浆加速，养分消耗加快，花色苷积累不充分而导致其含量降低；晚稻种植，全生育期气候适宜，糙米着色均匀，花色苷含量提高。  



　　蔡光泽研究发现，水稻花色苷含量与温度密切相关，高温使红米稻赤糯花色苷含量增加，糙米着色程度加深，而黑米稻朝紫则相反，低温使其花色苷含量增加，糙米着色程度加深，高温不利于着色；黑米稻在冷凉、昼夜温差较大地区种植，有利于提高其花色苷含量，而红米稻在温度较高、昼夜温差不大的地区种植有利于提高其花色苷含量。蔡光泽采用日本红米稻品种红浪漫和黑米稻品种奥之紫，分别设6个施肥处理，研究发现不同施肥处理对水稻花色苷含量影响不明显。  



3  水稻花色苷含量的遗传学研究  



3.1  水稻花色苷含量的遗传  



　　陈廷文选用3个黑米稻亲本与5个白米稻亲本杂交，运用6个群体组配设计，分析了黑米稻花色苷沉积性状在各世代的表现，结果表明，F1糙米颜色为不完全显性，显性度在组合之间有差异；广义遗传力和狭义遗传力呈极显著、显著或接近显著；黑米稻花色苷沉积性状受1对显性色素基因控制，存在加性、上位性和显性效应；糙米色泽由深黑至白色变化，呈数量性状表现，与花色苷基因的遗传密切相关。石帮志等利用红米稻材料天红和8个不同遗传背景和地理来源的籼粳水稻品种杂交，结果表明，红米稻花色苷含量主要受1对独立的显性基因控制，其他基因只是起修饰作用。伍时照认为黑米稻花色苷沉积性状受2对基因控制并且独立遗传；Zheng  等研究表明，紫黑稻花色苷含量性状由2对独立的显性基因通过互补作用所控制；石帮志等对紫香稻的研究表明，水稻花色苷含量属数量性状，至少受2对以上显性重叠基因控制，表现有剂量效应，每增加一个显性因子，水稻的花色苷含量就增加一点，糙米颜色也就相应地加深一级。  



　　Majumder用5个白米稻品种分别与1个褐色稻品种杂交，F1  均为亲本的中间型，F2  糙米颜色表现由深褐至微红以及白色7个等级，分离比为  1:6:15:20:15:6:1，认为水稻花色苷含量受3对基因控制，显性基因的累积剂量为0～6，在没任何显性因子(剂量为0)时呈白色，随着显性剂量的增加(1～6)，黑色呈线性加深。顾信媛等对黑米稻花色苷沉积性状进行分析表明，F2  糙米色泽分离8级，认为黑米稻花色苷含量受3对基因控制。吴平理等研究认为，黑糯米稻花色苷含量受3种基因控制：花色苷原基因，位于第6染色体上，有4个复等位基因；花色苷活化基因，位于第4染色体上，有4个复等位基因；紫米基因，位于第11染色体上，有1对基因，并且紫米基因对花色苷的合成起决定作用，如果没有紫米基因，即使有花色苷原基因和花色苷活化基因存在也不会是紫米。Park  等利用黑珍珠稻(黑米)/香米稻(白米)杂交后代研究结果表明，黑米稻花色苷含量是由相对独立的2个等位基因  C  和  A  以及1个调节基因  PLw  叫来控制，而褐色的基因型为  aaC-PLw。  



　　张名位  等采用3个糙米颜色深浅不同的黑米稻品种与1个白米稻品种配制6个杂交组合，测定  F2  单株黑米的花色苷含量结果表明，所有组合  F2  群体的花色苷含量的平均值介于双亲中间，并呈近似的正态分布，认为黑米稻花色苷含量是由多基因控制的数量性状遗传。选用6个黑米稻品种与1个白米稻品种作7×7完全双列杂交，按  Hayman  模型进行遗传分析表明，黑米稻花色苷含量的遗传符合加性-显性模型，高花色苷含量的等位基因对低含量的等位基因表现显性，种皮深黑色对浅黑色、黑色对白色为显性；显性等位基因对提高花色苷含量起增效作用，隐性等位基因起减效作用；且其广义遗传力和狭义遗传力均较高。Kim  等研究表明，在黑米稻/白米稻组合的  F2、F3  群体中，花色苷含量的变异表现为偏向于低含量亲本的连续分布，而黑米稻黑米稻组合的  F2  群体中表现为正态分布，是由多基因控制的数量性状。  



3.2  水稻花色苷含量与其他性状的遗传相关  



3.2.1  水稻花色苷含量与颖壳颜色的遗传相关  



　　陈廷文研究报道，水稻花色苷含量与颖壳颜色存在相关，其相关程度因颖壳颜色的深浅而有明显差异；F2  颖壳色深褐而糙米色深黑，花色苷含量高，相关系数为0.965，B1、B2  趋势亦同，分别为0.989  和0.945；随着水稻颖壳颜色的减弱而糙米的颜色也随之不同程度的减弱，相关系数变小。  



3.2.2  水稻花色苷含量与矿质元素含量的遗传相关  



　　张名位等研究报道，黑米稻花色苷含量与磷含量表现极显著正相关，与铁、锰含量表现正相关，与锌含量表现负相关。赖来展等研究发现，黑米稻花色苷含量与铁含量呈正的遗传相关，与磷含量的遗传达极显著正相关水平。koh  等研究表明，水稻中矿质元素阳离子如  K+、Mg2+、Ca2+、Fe2+  的增加与黑米稻花色苷的沉积有关。Zheng  等研究表明，紫黑稻花色苷含量与  Mg2+  和  ca2+  含量呈显著的正相关。  



3.2.3  水稻花色苷含量与产量、香味的遗传相关  



　　Zheng  等研究表明，紫黑稻花色苷含量与产量及产量构成性状、子粒充实度呈极显著负相关。Dong  等研究发现，黑米稻花色苷含量与香味性状具有一定程度的连锁关系。  



4  水稻花色苷含量的分子机理  



　　Matsumoto  等从水稻中分离到2个编码隐花色素的  cDNA，OsCRY1  和  OsCRY2，并且隐花色素能促进水稻花色苷积累。Buck  等从水稻基因组中鉴定出131个碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)基因，而  bHLH  族蛋白在花色苷生物合成过程中发挥重要功能。Druka  等从水稻中分离出查尔酮二氢黄酮异构酶(Cfi)基因，对突变体的研究表明，Cfi  基因在花色苷生物合成过程中具有不可或缺的重要作用。Hu  等从水稻中分离到2个  R  同族体包括  Ra1、Ra2  和  Rb，其中位于水稻第4染色体上的  Ra1  基因能够激活水稻花色苷的生物合成。Reddy  等鉴定出一个能积累原花色素但果皮不含花色苷的褐色稻品系  N22B，认为原花色素大量积累是因为水稻花色苷生物合成中，调控由无色花色素向花色素转化的花色素合成酶途径受阻。  



　　庄杰云等利用黑珍米×Basmati  370组合的  F2  群体，采用  RFLP  标记，将控制紫黑稻花色苷含量的显性主效基因定位在水稻第4染色体上，与  RG329  和  RG214  相连锁。Phoka  等利用  JHN  (红黑色稻)×KDML105(浅黄色稻)组合的  F2  群体，构建了一张包括114个  SSR  标记的水稻遗传图谱，检测到2个控制水稻子粒花色苷含量的  QTL  位点，位于  RM317～RM241  区间和  RM252～RM241  区间，这2个  QTL  被定位到水稻第4染色体上且紧密连锁。Reddy  等从水稻籼型品种  Purpleputtu  叶片  cDNA  文库中分离到一个编码查尔酮合成酶的  Oschs  cDNA，并将其定位在水稻第11染色体  RFLP  标记  RG2  和  RG103  之间，其中与  RG2  的距离为3.3  cM。Singh  等研究认为，控制水稻花色苷性状的基因具有多效性，能在水稻多个不同部位表达。  



　　Phoka  等通过  RT-PCR  分析发现，二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)基因表达受高温抑制，并且  DFR  基因的稳态转录和水稻花色苷含量密切相关，20  ℃  条件下水稻花色苷含量为  594.96  μg/g，34  ℃  条件下水稻花色苷含量为112.66  μg/g；紫米稻  DFR  转录体高温下的  RT-PCR  产物包括506  bp  和394  bp  2种片段，凉爽温度下只含有394  bp  的片段，然而白米稻中506  bp  未剪接的  mRNA  在高温和凉爽温度条件下都能检测到；推测紫米稻中携带温度敏感等位基因  DFR  X，白米稻中携带温度敏感等位基因  DFR  Y。截至目前，已报道克隆的与水稻花色苷含量相关的基因，包括花色苷-5-芳香酰基转移酶基因  OSJNBa0044A10.13、OSJNBa0054L03.25，花色苷膜蛋白1基因  P0666G10.131，花色苷-5-O-葡萄糖基转移酶基因  OJ1135  _F06.22，花色苷-5-芳香酰基转移酶类蛋白基因  OSJNBa0077F02.115、OsJNBa0054L03.23、P0036H07.46，花色苷酰基转移酶基因  OJ1201  _E07.32。  



5  富集花色苷水稻种质资源鉴定、筛选与创新  



5.1  富集花色苷水稻种质资源鉴定与筛选  



　　Park  等通过测定326份不同水稻种质资源的矢车菊花色素-3-葡萄糖苷含量，鉴定出10份富含花色苷的水稻种质资源，其花色苷含量大小顺序为Heugjinjubyeo(5520  μg/g)＞Cheng  Chang(3210  μg/g)＞Kilimgeugmi(2400  μg/g)＞Pl1609-79-2(2240  μg/g)＞Hong  Shei  Lo(2210  μg/g)＞Heugna  Mbyeo(1910  μg/g)＞Mitak=P11609-79-1(1860  μg/g)＞Suwon  425(1630  μg/g)＞Sanghaehyanghyeolla(1080  μg/g)。  



5.2  富集花色苷水稻种质资源的创新  



　　据现有资料统计，十多年来国内培育的黑紫米稻品种主要有：黑珍米、龙锦1号、龙晴4号、秦稻1号、黑丰糯、黑优粘、上农黑糯07、黑优占、黑宝、河大144、乌贡1号、北京黑香粳、紫香糯、博优黑恢杂交稻、籼型三系杂交黑糯等，其中龙锦1号花色苷含量达到2.4％，比一般黑米高出2～5倍；国外培育的黑紫米稻品种有：日本的  Asamurasaki，美国的  A-204、Jasmine85、Drew，韩国的  Heugnambyo、Heugjinjubyeo，意大利的  Venere。  



　　国内培育的红米稻品种有：红香籼糯、红香玉、南红宝、桂红占、北京红香粳、枣红糯、紫红稻4号、槟榔红香米杂交稻、华农红米等；国外培育的红米稻品种有：印度的  ASD  17、Red  Trireni，美国的  A-201，日本的筑紫红糯等。  



　　上海交通大学以巨胚稻6601为母本与黑米稻D9953-1-2及红米稻  CF9990  杂交，育成黑巨胚稻04和红巨胚稻02两个粳型新品系。韩龙植等将系谱选择和花药培养相结合，培育出甜黑米1569、黑糯米1568、甜红米1571、红米1201、红香米1570、红糯米1572等一系列富集花色苷的优良水稻种质。  



6  展望与建议  



6.1  积极开展富集花色苷水稻种质资源鉴定与筛选  



　　色稻是世界稻种资源中的珍贵类型，主要分布于中国、斯里兰卡、印度尼西亚、印度、菲律宾、孟加拉、马来西亚、缅甸等东亚、东南亚和南亚等地区。目前我国保存的水稻种质资源中，色稻品种占10％左右，其中黑米稻种质有411份，红米稻种质有8963份，不乏花色苷含量丰富的水稻品种。由于认识不足，再加上经费和检测技术等原因，目前对于富集花色苷水稻种质的鉴定和筛选工作开展的极少，应在参照国内外富集花色苷水稻种质鉴定基础上，积极开展对现有色稻种质资源的鉴定，力求筛选出高花色苷含量的优异水稻种质。为后继的目标基因发掘、种质创新以及水稻花色苷含量分子调控机理等研究提供新材料。  



6.2  加强水稻花色苷含量的基因定位研究  



　　遗传分析表明，水稻花色苷含量是由多基因控制的数量性状，受基因型和环境效应的共同影响。长期以来，由于缺乏简便快速的水稻花色苷含量的鉴定方法以及等级评价标准，人们往往根据糙米颜色的深浅直接对花色苷含量进行分级；由于分离群体糙米颜色多为中间类型，所以依据传统的方法对其进行等级鉴定就带有很大的主观性和盲目性，限制了对水稻花色苷含量性状的深入研究。随着经济有效、快速简便的水稻花色苷含量检测方法的出现，利用现代分子生物学技术和理想的分离群体，通过多年多点重复性试验，期望找出能够重复检测、对表型变异解释较大、并能稳定遗传的  QTLs。最终克隆出具有自主知识产权的控制水稻花色苷含量的主效基因，为富集花色苷水稻的基因改良和分子标记辅助选择提供物质基础。  



6.3  深入开展水稻花色苷含量的分子调控机理研究  



　　水稻花色苷的沉积和积累涉及一系列复杂的生理、生化反应，受结构基因和调节基因的共同影响，与子粒发育过程中花色苷含量相关基因的表达状况密切相关。目前对于水稻花色苷含量相关基因的分子调控机理方面的研究开展极少，应在深入研究的基础上，运用甲基化、去甲基化等一系列基因修饰手段，通过抑制或促进某些基因的表达，提高水稻花色苷含量水平。  



6.4  进一步加强富集花色苷水稻种质创新  



　　随着分子生物学、功能基因组学和生物信息学研究的不断深入，通过聚合杂交和基因工程等手段，将高花色苷含量基因转入到综合评价优良的水稻品种中，创造在大多数生态环境中花色苷含量基因都能稳定高效表达的水稻新种质，以满足高花色苷含量水稻育种和生产以及国内外稻米市场的广泛需求。