自然-方法学:值得关注的新技术

　　

生物通综合：

Nature Methods 3, 498 (2006) doi:10.1038/nmeth0706-498b 

CHEMICAL TOOLS

跨膜通路有了定量测定方法
Irene Kaganman 

研究者利用虫荧光素实验系统，成功地对释放性虫荧光素运输机共轭物进入细胞的通路进行了测定。 

生物是如何跨越生物性屏障的呢？如何理解这一问题，对于药物开发和基础性研究都很重要。但是，目前的方法仅仅能对横跨膜的通路进行定性评估。美国斯坦福大学的Paul Wender及其同事则希望突破定性理解的局限，寻找到一个更为定量的工具。 

他们设计出了一个释放性的虫荧光素运输机系统，它包含一个精氨酸八聚体运输机，该运输机通过一个二硫化物连接器和一个虫荧光素分子形成共轭关系。在细胞入口处，连接器裂解开来，释放出自由的虫荧光素。这一结构被吸收到细胞中的状况，能够在表达有荧光素酶的细胞中进行测定。该过程催化了虫荧光素的氧化过程，促成了一个光子的释放。“这一系统的美妙之处在于，不像荧光那样，我们这里对每一次周转事件都能获得一个光子，因此它在早期就可以被定量化的，” Wender说。 

Wender及其同事的工作发表在《美国化学会期刊》上。他们报道说，在稳定感染有荧光素酶编码基因的前列腺癌细胞中，发生了释放性虫荧光素运输机共轭体的合成过程，同时他们还对该系统的有效性进行了研究。根据发光情况，他们能够对该共轭体的吸收和释放进行实时的定量化测定。 

掌握了上述方法，这些研究者现在能够对不同类型细胞和组织中的货物运输和传递进行研究，同时他们也能设计出共轭物，它能达到渴望的速率，有效地运送分子并释放出它们。更进一步说，这一方法能够用于对生物活性目标表达水平的定量测定，比如说细胞和组织中的蛋白酶：研究者先是设计出一种带有连接器的运输机，它包含有一种特定的蛋白酶裂解位点；然后，运用这种荧光素酶方法来测定该酶的活性。通过应用这一信息，他们能够设计出将他们的货物仅仅释放入特定组织中的共轭体。 

该虫荧光素系统的一个重要优点在于，研究者不必要对细胞或切片组织进行固定化处理，甚至也没有必要将动物杀死。正如Wender所概括的那样，“它可以使你接近到你在研究中所想要达到的程度。也就是说，你仅仅是观察一些东西，但并不打扰它们。你将一些信号输入进去，然后一些信号出来了，那就是光子，这样它就可以对你的实验效果进行定量化了。” 

REFERENCES 
1. Jones, L.R. et al. Releasable luciferin–transporter conjugates: tools for the real-time analysis of cellular uptake and release. J. Am. Chem. Soc. 128, 6526–6527 (2006). | Article | PubMed | ChemPort | 

Nature Methods 3, 498 (2006) doi:10.1038/nmeth0706-498a 

PROTEIN BIOCHEMISTRY

细菌荧光方法加速目标序列的鉴定
Michael Eisenstein 

一种新的以荧光为基础的细菌展示方法，能大大加速对目标序列的鉴定过程，而这些目标序列来自于很多新增的未被研究的蛋白酶。 

到目前为止，在人类蛋白质组中已经发现了近700个蛋白酶。随着被鉴定的蛋白酶数量不断攀升，对高通量、高可靠性的专注于目标序列特征的实验方法的需求，已经变得日益明显起来。近年来，人们检验了很多筛选方法，其中涉及病毒展示、集群性底物文库和缩氨酸排列，运用这些方法已经获得了一些关于非特异性蛋白酶的目标特异性和动力学的重要信息。 

美国加州大学圣巴巴拉分校的研究者Patrick Daugherty及其研究生Kevin Boulware，现在为人们的蛋白质组工具箱新增了另外一种很有前景的方法，该方法是建立在对细菌展示文库的荧光活性细胞分类（FACS）基础上的。他们使用的文库是由大肠杆菌这些单细胞生物构成的，而在这些细胞上表达有怪异的表面蛋白。连接到一个易变的六残基底物区域的束缚有链霉亲和素的缩氨酸，构成了这些表面蛋白的一部分。这一文库标记有一个荧光性的与链霉亲和素成共轭关系的藻红蛋白探针，而它是束缚在怪异的展示蛋白上的；接着，这些荧光标记的细胞是用相关的蛋白酶处理的。表达有合适的目标序列的细胞，由于蛋白酶裂解的原因，失去了原有的荧光特性，而且也能通过FACS方法，依据扩展和特性，来进行分类。Boulware和Daugherty已经将这种筛选方法命名为缩氨酸底物“回形针”的细胞文库筛选法。 

他们使用两种蛋白酶，即caspase-3蛋白酶和肠激酶，检验“回形针”来确定哪些标准底物已经被鉴定出来。经过多轮筛选，他们鉴定出了几种单克隆，来对每个蛋白酶进行恰当的底物序列的包裹。对有着最为高效的裂解动力学特征的克隆体进行的DNA测序工作，揭示出了一个caspase-3蛋白酶共同靶点序列，而它和以前被鉴定的那个标准底物DxVDG是十分相匹配的。相比之下，这个研究小组非常惊奇地鉴定出了几个肠激酶底物，它们和已经建立的DDDDK目标序列具有实质性的差异，但被裂解得更有效率。他们随后在使用合成性的荧光缩氨酸底物的其它方法中，确认了不同目标序列的相对动力学特征。研究者把他们自己的这种方法鼓吹为一种快速检测蛋白酶特性和裂解动力学特征的方法，并建议说，该方法也同样可以扩展应用于哺乳动物细胞或酵母细胞，这样以来研究者就有可能检测有关对裂解行为后翻译修饰过程的影响效果。 

REFERENCES 
Boulware, K.T. & Daugherty, P.S. Protease specificity determination by using cellular libraries of peptide substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 7583–7588 (2006). | Article | PubMed | ChemPort| 

Nature Methods 3, 496 - 497 (2006) doi:10.1038/nmeth0706-496b 

PROTEOMICS

科学家发现携带噪音的蛋白质
Allison Doerr 

研究者通过联合运用绿色荧光蛋白标记的酵母文库和流体血细胞计数器，现在能够获得单细胞水平下的蛋白质组信息，从而揭示出生物噪音的基本结构。 

虽然DNA微阵列芯片技术已经促成了基因组分析的革命性变化，但它并不能为我们提供有关细胞内部工作机制的完整图景。比如说，人们普遍知道，信息RNA的合成水平并不总是和被表达的蛋白质水平是相关的。人们利用蛋白质组技术，获得的信息在细胞行为方面较信息RNA合成水平的单独测定方面更为丰富；细胞生物学家认为蛋白质组技术是对现有技术的有益补充。 

“如果你想对一个细胞的工作机制有任何了解的话，那你就不得不了解其中的噪音来自何处，它的存在是多么得普遍，它的生物学效应是什么，”美国加利福尼亚大学旧金山分校的Jonathan Weissman这样解释，他和博士后John Newman一同设计出了一种流体血细胞计数方法，用于调查全球范围内的蛋白质表达变异的情况。目前市面上已经存在着一种利用绿色荧光蛋白（GFP）标记的酵母文库，其中的每一个蛋白质都会在它的染色体天然位置表达为一个来自内生促进剂的C端GFP融合体。他们使用这一文库，开发出了顾客定制型软件，用于控制细胞向流体血细胞计数器中的运送行为，从而进行荧光的定量测定和数据分析。 

他们的这一实验系统，可以对2500多个蛋白质进行测定，占了整个酵母蛋白质组的60%左右。Weissman认为，利用一种红色荧光蛋白变异体，对自荧光问题进行规避，从而可以将上述数值提高。每个细胞的荧光测定值，精确地反映出了被标记蛋白的丰富程度；蛋白质表达中的细胞到细胞的变异，或者说是“噪音”，能很容易地根据流体血细胞计数器得出的数据进行计算。“我们不仅仅能够获得了非常高质量的蛋白质组信息，而且，我们也能利用单细胞方法得到它。这一点是利用DNA微阵列芯片方法所无法实现的，” Weissman解释说。 

这一巧妙的实验设计，使得Weissman、Newman及其同事可以对细胞中的生物噪音结构进行全球范围内的测定。例如，展示有极低噪音的蛋白质涉及到翻译过程和蛋白质降解过程。携带有噪音表达的蛋白质则包含那些和染色质重塑有关的蛋白质。毫不奇怪的是，一些有着最大程度变异或者是噪音表达的蛋白质，对于正在发生着变化的环境，是最先的反应者；这些蛋白质包括那些和压力应对和热休克相关的蛋白质。Weissman评论说：“具体内涵是，这也许对于在某一种条件下要产生出显型多样性的细胞来说，是一条可行之路，以致于条件变化了，仍然至少有一部分细胞，它们能够以更为优化的状态对变化的条件发生反应。” 
REFERENCES 
Newman, J. R. S. et al.Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature; published online 14 May 2006. 

Nature Methods 3, 496 - 497 (2006) doi:10.1038/nmeth0706-496a 

MICROSCOPY

显微镜技术推进高尔基体研究
Allison Doerr 


两个独立的研究小组运用荧光标记技术和先进的视频显微镜技术，获得了高尔基体潴泡成熟模型视觉方面的证据。 

高尔基体，是一种细胞器官的有趣名称。从某种意义上讲，它在细胞中的作用就像一个邮局，先接收来自内质网新合成的蛋白质，接着对其实施翻译后修饰过程，最后再将这些被修饰好了的蛋白质发送到细胞中的合适目的地。在过去的几十年中，人们一共建立了两种模型，即水泡运输模型和潴泡成熟模型，用它们来描述促分泌的蛋白质是如何从早期的高尔基潴泡单元转移到晚期潴泡的。 

根据水泡运输模型的预测，高尔基潴泡是一些没有太多变化的稳定单元。但是，潴泡成熟模型则认为，高尔基潴泡是瞬时的、不断演化的结构体。虽然生化研究方面的证据支持这两种理论（在一些情况下，支持两种理论的“杂合体”），但是，人们依然在高通量活细胞成像技术方面没有获得有关视觉方面的支持。近来，《自然》杂志同时发表了两篇论文，介绍在共焦距显微镜技术方面的新进展。该项研究的主角来自两个独立的研究小组，他们分别是美国芝加哥大学Benjamin Glick研究组和日本RIKEN发现研究所的Akihiko Nakano研究组。 

Glick和Nakano两个小组使用的都是酵母细胞，高尔基潴泡在酵母细胞当中并不会发生堆积，这样以来更容易对单个的潴泡进行可视化拍摄。此前，最大的技术挑战就是如何开发出先进的成像技术；两个小组开发出了顾客型三维共焦距视频显微镜技术系统，从而可以首次进行多色的活细胞成像。“我们现在能清晰地观察到酵母高尔基体潴泡的管状网络结构，此前我们从来没有想象过不使用电子显微镜就能看到它，” Nakano说。两个研究小组运用绿色荧光蛋白对前期高尔基体常住蛋白进行标记，运用一种红色荧光蛋白变异体对一种后期高尔基体蛋白进行标记（反过来也是如此）。他们提出假说认为，如果穿越高尔基体的蛋白是通过水泡运输的，那么就无法确定标记单个早期潴泡的绿色荧光能否被保留下来。然而，如果潴泡从早期状态到后期状态变得成熟起来，这时候荧光就会从绿色转变为红色，因为潴泡获得了一些新的生化特征。 

这两个小组很清楚地观察到，单个的早期绿色潴泡在几分钟之内就变成了红色。“这些颜色变化很明确地表明，简单的传统水泡运输模型是不适用的，” Nakano解释说。对于潴泡成熟的视觉证据是如此清楚地被排除出去，Glick也感到惊讶。“我们一直担心的是，高尔基体潴泡也许经常会经受融合和裂解的变化，这些事情将会使解释变得复杂起来，”他说。 Glick和Nakano为细胞生物学领域这一长期悬而未决的问题找到了答案。这也是一个极好的例证，说明为了同一目标合作比竞争更能获得丰富的成果。“这些论文将被仔细审查，因此花些时间做这些实验非常重要，”Glick说。“我们两个小组各自独立地获得了这些相近的结论，这一事实正得到确认，我们在这一领域也应该比其他人的工作更有说服力。” 

REFERENCES 
Losev, E et al.Golgi maturation visualized in living yeast. Nature; published online 14 May 2006. 
Matsuura-Tokita, K. et al.Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation. Nature; published online 14 May 2006.