细菌荧光方法加速目标序列的鉴定

　　

    一种新的以荧光为基础的细菌展示方法，能大大加速对目标序列的鉴定过程，而这些目标序列来自于很多新增的未被研究的蛋白酶。

    到目前为止，在人类蛋白质组中已经发现了近700个蛋白酶。随着被鉴定的蛋白酶数量不断攀升，对高通量、高可靠性的专注于目标序列特征的实验方法的需求，已经变得日益明显起来。近年来，人们检验了很多筛选方法，其中涉及病毒展示、集群性底物文库和缩氨酸排列，运用这些方法已经获得了一些关于非特异性蛋白酶的目标特异性和动力学的重要信息。

    美国加州大学圣巴巴拉分校的研究者Patrick Daugherty及其研究生Kevin Boulware，现在为人们的蛋白质组工具箱新增了另外一种很有前景的方法，该方法是建立在对细菌展示文库的荧光活性细胞分类(FACS)基础上的。他们使用的文库是由大肠杆菌这些单细胞生物构成的，而在这些细胞上表达有怪异的表面蛋白。连接到一个易变的六残基底物区域的束缚有链霉亲和素的缩氨酸，构成了这些表面蛋白的一部分。这一文库标记有一个荧光性的与链霉亲和素成共轭关系的藻红蛋白探针，而它是束缚在怪异的展示蛋白上的；接着，这些荧光标记的细胞是用相关的蛋白酶处理的。表达有合适的目标序列的细胞，由于蛋白酶裂解的原因，失去了原有的荧光特性，而且也能通过FACS方法，依据扩展和特性，来进行分类。Boulware和Daugherty已经将这种筛选方法命名为缩氨酸底物“回形针”的细胞文库筛选法。

    他们使用两种蛋白酶，即caspase-3蛋白酶和肠激酶，检验“回形针”来确定哪些标准底物已经被鉴定出来。经过多轮筛选，他们鉴定出了几种单克隆，来对每个蛋白酶进行恰当的底物序列的包裹。对有着最为高效的裂解动力学特征的克隆体进行的DNA测序工作，揭示出了一个caspase-3蛋白酶共同靶点序列，而它和以前被鉴定的那个标准底物DxVDG是十分相匹配的。相比之下，这个研究小组非常惊奇地鉴定出了几个肠激酶底物，它们和已经建立的DDDDK目标序列具有实质性的差异，但被裂解得更有效率。他们随后在使用合成性的荧光缩氨酸底物的其它方法中，确认了不同目标序列的相对动力学特征。

    研究者把他们自己的这种方法鼓吹为一种快速检测蛋白酶特性和裂解动力学特征的方法，并建议说，该方法也同样可以扩展应用于哺乳动物细胞或酵母细胞，这样以来研究者就有可能检测有关对裂解行为后翻译修饰过程的影响效果。