质谱新技术检测大肽段生物标志

　　

生物通报道：利用一种新型的质谱仪（hybrid mass spectrometer）和特制的肽分析软件（peptide profiling software），可以在色谱同时对潜在的肽段标志进行分析和定量测定。

人类的健康和疾病的防治始终是医学的目标，而其中疾病的早期诊断又是达到这一目标的重要环节。一些蛋白质或者降解后的片段，可以作为肿瘤等疾病的生物标志物而用于早期诊断。然而，迄今能在常规临床使用的新的生物指标还非常的少。在蛋白质组问世以后，人们将疾病的早期诊断的生物指标寄希望于蛋白质组的技术和由血清蛋白质组得到的数据。无数的研究小组致力于追踪那些有可能成为疾病标志物的多肽或者代谢产物，使得寻找生物标志物（biomarkers）的工作格外繁荣。目前的常用技术中，以双向电泳和质谱最为突出，两种方法都可以用于比较正常和疾病状态下蛋白质组分的变化情况。

几位美国科学家在质谱法的基础上，将线性化离子阱（linear ion trap）和傅立叶变换离子回旋共振质谱法（ Fourier transform ion cyclotron resonance cell）相结合，得到一种混合型质谱（hybrid mass spectrometer）。Amylin Pharmaceuticals公司的Steven Taylor及其同事在对LC/MS改造的基础上，设计出一种在各个实验室都通用的方法，可以用于以大片段肽段激素 为主要目标的生物标志物研究和药物研发。

    Taylor指出，基于激光解析电离化（laser desorption/ionisation）原理的质谱法虽然经常被用于研究肽段的不同性能，但对于一些较大的肽段需要预分离处理（pre-separation）。LC/MS法 某种程度上内含预分离处理，但是由高价区信号重叠也会给检测大片段肽段带来麻烦。新方法可以对大肽段在色谱同时进行完整蛋白质的研究（top-down approach）。

研究人员在Rin-m5F胰岛瘤细胞 培养物中对新技术进行验证。这种胰腺肿瘤产生过量的胰岛素。通过改变外界刺激信号可以调控分泌情况。Rin-m5F细胞分别在含有/不含有forskolin的培养 基中进行培养。对经过外源诱导处理后胰岛素的分泌变化进行监测。Forskolin是常用于提高cAMP水平 的二萜，cAMP是调控激素的信号载体。样品之间的差别通过取样后混合从而最小化。经过多肽小柱进行样品固相抽提后得到多肽。

抽提混合物不需进一步处理，利用nanotrap和 分析柱对混合物进行LC/MS电离质谱分析（electrospray ionisation）。对于每一种洗脱蛋白分析进行高分辨率（100000）傅立叶变换离子回旋共振（FT/ICR mass spectra）全扫描和MS/MS质谱分析，全扫描离子阱和MS2、MS3光谱也被 记录。

采用SEQUEST程序对多肽进行串联质谱分析，可以对某些翻译后加工过程如：蛋氨酸氧化（＋16u）、N-末端乙酰化（＋42u） 进行鉴别。所得成分进一步得到FT/ICR得到的精确数据验证。对于这种方法 未能鉴别出来的大肽段，则采用FT MS/MS的数据和Protein Prospector程序的MS Tag模块分析。

    借助商业软件包DeCyder MS，从这些的数据构建出FT肽段质谱 并进行比较，轻松地分辨来自经过诱导和未经过诱导培养产物的肽段。共有41种肽段被鉴别出来，利用这些图谱测定可以对其中37种的相对含量进行测定用。经过后继的双向电泳实验进一步 比较并寻找潜在的生物标记。

以amylin为例，在forskolin诱导的两个样本中检测到FT MS和离子阱MS/MS信号，提示可以测量到生理学水平（20pM）的肽段激素。Forskolin诱导后 丰度增长量最大的肽段来自嗜铬粒蛋白A和B的 降解产物，正是癌症的生物标记。共检测出5种嗜铬粒蛋白A肽段和21种嗜铬粒蛋白B肽段，包括它们C-末端不同的翻译后修饰基序，比如 氨基化序列和磷酸化序列。丰度最大的改变是C-末端包含氨基乙酸的前体，提示Forskolin 诱导合成新的加工程度很低的肽段。

另外，新发现了4种新的可卡因、安非他命调控的转录本（CART）和其它一些分泌肽段。经过Forskolin处理后没有改变的两种蛋白是ubiquitin和超氧化物歧化酶。

混合型质谱和分析软件的联用被证明可以成功地鉴别和比较在研究的肽段丰度。然而57种分子量小于15KDa的多肽没有鉴别出来，其中一些具有很好的分段光谱，Taylor说需要完整蛋白质的研究技术加以完善。

    尽管实验得到了成功，但是受限于仪器价格的昂贵。目前正在被推荐使用的离子阱和静电场轨道阱串联（hybrid ion trap-orbitrap）应该是一种比较不错的替代产品。（生物通记者宗敏）