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药物研究警示:发现RNAi技术致命性缺陷
【字体: 大 中 小 】 时间:2006年05月30日 来源:生物通
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生物通报道:RNA干涉技术(RNAi)不仅己经成为了科学研究的一种重要工具,而且在临床治疗方面也发挥了越来越重要的作用,然而来自斯坦福大学医学院小儿科与遗传学等处的研究人员发现作为RNAi技术要点的shRNA(短发夹状RNA)的长期使用对于实验小鼠具有极大的危害,这为RNAi技术应用提出了严重的警示。这一研究成果公布在本期(5月25日)Nature杂志上。
研究概述:RNA干扰是近几年发展起来的一项技术,它能够定向关闭生物体内的某一基因,使其不发挥作用。虽然尚处在初期阶段,但是这一技术已经被看作是一种用来沉默基因的具有潜在重要性的治疗方法:通过将shRNA序列转染入细胞,或者通过病毒介导(腺病毒或或逆转录病毒)进入细胞,当体内这一序列被表达出来就可以长期抑制发病基因的表达。
这一研究得到了许多研究人员的认可,在2001年还被《Science》杂志评为十大科学进展之一,但是斯坦福大学的研究人员将49种不同的大剂量shRNA注入小鼠肝细胞(hepatocytes)后发现36种shRNA对小鼠的肝脏有伤害作用,其中23种甚至导致小鼠在两个月内死亡。进一步研究发现这些shRNA的致命毒性可能是由于shRNA与肝脏来源的microRNAs(miRNAs)为竞争与Exportin-5(一种核karyopherin蛋白,这种蛋白是一类与核孔选择性运输有关的蛋白家族,相当于受体蛋白,其中imporin负责将蛋白从细胞质运进细胞核,exportin负责运出)结合造成的。
实验思路:在最开始研究中,为了弄清楚到底是什么导致了小鼠死亡,研究人员用这种病毒载体单独进行实验,表明这种病毒不是致死的原因,酶联免疫吸附分析(ELISA)和Western blot分析找不到干涉反应中RNAi的激活。另一种理论解释说shRNAs是有毒性的,因为它们不是无靶标的RNA,但研究人员用了6种不同的靶标和23种不同的shRNA进行实验,得到了相似的结果,使他们认为靶标很可能不是致死的原因。
高的shRNA水平通常与毒性相关联,表明毒性shRNA使细胞的shRNA加工机器处于过饱和状态从而阻碍了microRNA(miRNAs)靠近蛋白。研究者们利用人肝细胞大量表达的肝脏miRNA—miR-12进行体外荧光实验。他们发现大量表达毒性shRNA可以抑制miR-12的加工,而不杀死宿主细胞的shRNA则对miR-122加工具有较少甚至没有影响。exportin-5的过量表达可以增强shRNAs 和 miRNAs的基因沉默效果,表明这种蛋白有可能是shRNAs和miRNAs进行竞争的重要资源。
“这些发现是惊人,”来自位于Cleveland的Case Western Reserve大学的Timothy Nilsen,表达量和毒性之间的相互联系不是完美的,所以“会很有趣的发现假如利用弱启动子有效地表达毒性或者致死的shRNA,但他们不具备毒性效果。这很清楚的表明表达水平的更重要。”加州大学洛杉矶分校的Irvin Chen,同样指出了他的发现,一些靶向CCR5 用于治疗HIV-1的shRNAs被证实在人类初级T细胞和嵌合体小鼠中长期使用具有毒性。而其他一些shRNA在同样的情况下没有显示毒性。“我们积累了越多关于有毒和无毒的siRNA,我们就能更好利用这种机制,并且能够在将来预言它们的毒性。“他说。
研究警示:这一研究提醒各研究人员在进行人体RNA干扰试验时一定要更加谨慎,但是斯坦福研究人员也表示可以通过控制优化shRNA的剂量也许可以有助于RNA干扰治疗,正如他们在针对人类乙型肝炎病毒做的RNAi治疗。
目前RNAi技术确实是在治疗一些顽固性疾病(比如艾滋病,癌症)方面起到的作用,研究人员需要进一步解析为什么有些RNAi治疗起到了作用,而有些却是有害的。(生物通:张迪)
原文:
Nature 441, 537-541 (25 May 2006)
Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways
[Abstract]