技术结合发现在DNA修复中起重要作用的蛋白

　　

生物通报道：DNA有两个最厉害的“敌人”——紫外线和化学致癌物质，这两种元素可以通过突变单个核苷酸或者改变它的物理结构进行对DNA的严重破坏。在许多情况下，生物体由特定的一批蛋白对特定类型的损伤进行修复来保证基因组的完整性。来自MIT麻省理工的研究人员发现了一种毛发硫营养不良症状组分A（trichothiodystrophy group A，TTDA）在DNA修复和转录过程中的重要作用。这一研究成果公布在5月PLoS Biology杂志上。

核苷酸切除修复(NER)的机制聚集和调控了大概25种蛋白对损伤结构进行识别和切除，其中包括针对紫外线诱发的损伤。这一修复机制的中心成员是一种由10个亚基的转录/修复因子IIH (transcription/repair factor IIH，TFIIH)组成的复合体——正如名字暗示的那样，除了修复DNA作用外，这一复合物还具有调节转录的作用。

TTDA是三种TFIIH基因——XPB, XPD和TTDA之一，被证实与一种稀少的光敏型遗传早熟老化综合症——毛发硫营养不良(TTD)相关——该综合症的特点是：毛发和指甲易碎，鳞状皮肤和神经恶化。

为了研究TFIIH复合体功能中TTDA亚基的作用，Giuseppina Giglia-Mari等人通过绿色荧光蛋白(GFP)标记TTDA 和XPD 亚基，利用高分辨率的共聚焦显微镜观察和对比它们的运动和行为。结果发现TTDA-GFP 与XPD-GFP稳定地组成TFIIH并且参与DNA修复，而且与仅定位于细胞核内的XPB亚基相比，在细胞质和细胞核中都可以观察到TTDA-GFP 和 XPD-GFP。为了证明在细胞质中TTDA和 XPD是否与TFIIH聚集，研究人员采用了一种定制运动监视技术——光脱色荧光恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching，FRAP)。他们观察到TTDA动态的与TFIIH 结合，并且TTDA仅仅当进行NER而不是转录的时候才稳定地组成TFIIH。

Giglia-Mari等人由此得出结论：在核心的TFIIH复合体吸附到DNA损伤处后，一旦TTDA进入到正确的位置，将会引起构象上的改变来召集其它一些用于修复的亚基。TTDA也可帮助TFIIH正确折叠，防止它的降解和积累TFIIH到达一种进行NER功能所需的水平。这些观察解释了为什么不能产生TTDA的人们经受了这种衰弱的症状。
（生物通：张迪）

附：

光脱色荧光恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching，FRAP)

研究膜流动性的一种方法。首先用荧光物质标记膜蛋白或膜脂, 然后用激光束照射细胞表面某一区域, 使被照射区域的荧光淬灭变暗形成一个漂白斑。由于膜的流动性,漂白斑周围的荧光物质随着膜蛋白或膜脂的流动逐渐将漂白斑覆盖，使淬灭区域的亮度逐渐增加, 最后恢复到与周围的荧光光强度相等。

细胞膜蛋白的标记方法有很多种。可以用非特异性的染料,如异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)将细胞膜蛋白全部进行标记。也可用特异性的探针,如荧光抗体,标记特异的膜蛋白。膜蛋白一旦被标记就可用激光束进行局部照射处理,使荧光脱色,形成直径约为1μm的白斑。若是可移动的膜蛋白,则会因蛋白的移动,使白斑消失,若是不能移动的蛋白.则白斑不会消失。

根据荧光恢复的速度, 可推算膜脂的扩散速度为每秒钟为几个微米，而膜蛋白的扩散速度变化幅度较大，少数膜蛋白的扩散速度可达到膜脂的速度，大多数蛋白的扩散速度都比膜脂慢，还有一些膜蛋白完全限于某一个区域。正是这种限制，使膜形成一些特定的膜微区(membrane domain),这些微区具有不同的蛋白组成和功能。这实际上是膜蛋白不对称分布带来膜功能的不对称。

FRAP技术也有它的不足之处。第一,它只能检测膜蛋白的群体移动,而不能观察单个蛋白的移动。其次,它不能证明膜蛋白在移动时是否受局部条件的限制。为了克服这些不足,发展了单颗粒示综(single-particle tracking,SPT)技术,可以用抗体金(直径15～40 nm)来标记单个膜蛋白,然后通过计算机控制的摄像显微镜进行观察。