科学家开发出高通量激酶组分析法

　　   两种新开发的高通量激酶组分析方法，可为研究者提供他们感兴趣酶类的目标物和调节机制的丰富信息源。

    近来，我们很难找到一本生物学研究期刊不发表有关蛋白磷酸化途径研究的。存在这种情况并不惊奇，因为在每一个重要的细胞生命过程中磷酸化过程都会发挥一定的作用。但是，如果要说真正有何惊奇的话，那就是人们实际上对激酶组的构成知之甚少。“如果没有几万种的话，那至少在酵母中也可能存在着几千种磷酸化过程，对于人类来说，存在几万种肯定不成问题，”耶鲁大学的研究人员Michael Snyder分析说：“但是，当我们实际上浏览一下文献，就发现报道的酵母磷酸化过程不超过160种。”

    在《自然》杂志新近发表的一篇文章中，Snyder的研究小组介绍了一种解决这种问题的方法。这是一篇关于高通量识别蛋白组目标物的论文，文中的方法被用来筛选87种不同的酵母激酶。该研究小组开发了一种含有75%酵母蛋白组的蛋白组表达文库，在复制序列上进行蛋白质点标记；接着他们将这些序列暴露于含有放射性ATP的激酶中，以便在可重复产生信号的质点上鉴别特定性的交互作用。Snyder的研究小组对4000多次磷酸化过程进行了鉴别，然后把它们集合起来制作成一个详细的激酶组图谱。这篇论文也介绍了有关调控机制的重要信息，通过这一机制，激酶和目标物系列能进行交互作用和调节彼此的活动。Snyder 说：“很显然，真核细胞恰恰喜欢使用一些基本的回路。”

    哈佛大学的研究人员Erin O'Shea也对开发新的激酶底物鉴别系统感兴趣。然而，她并不是着眼于整个激酶组，而是设法了解一个名为“Pho85”的细胞周期素依附型的特定酵母激酶的信息。她使用的是“门卫”策略，该方法首先由加州大学旧金山分校的Kevan Shokat研究小组开发出来，使用的是能够用ATP类似物催化磷酸化过程发生的Pho85突变体。O'Shea的研究小组通过对含有4000多种蛋白的标记文库进行筛选，获得了Pho85突变体，他们同时在酵母提取物中进行一定的反应以便重复自然发生的条件。接着，他们对标记蛋白进行免疫纯化处理；当发现一个标记蛋白能成功被放射性ATP类似物标记的话，该蛋白就可以被看作公认底物。O'Shea的研究小组鉴别出了24种潜在目标物，从现有的数据判断，其中有几个看来非常可行。“我们鉴别的底物，其生物学特征和Pho85的相关特征非常一致......通过基因研究，”她说：“我们鉴别得到的底物确实和活体底物具有相关性，这是鼓舞人心的标志。”

    使用不同的Pho85-细胞周期素组合，可观察到变化的特征，这也令O'Shea的研究小组感到惊奇。“活体状态下激酶展示的特征具有巧妙性，”她说：“我们将具有相同催化亚基的两种激酶对同一底物进行磷酸化反应的能力进行了对比，结果发现它们具有明显不同的特征。” Snyder也对他自己小组获得的有关Tpk激酶的结果感到惊奇：“从遗传的角度讲，至少在某些方面Tpk被认为在功能上彼此是重复多余的，但现在我们发现它们在功能上是截然不同的。”

    活体检验是下一步研究的关键。O'Shea认为，这种验证能强有力支持她论文中介绍的关于对单个激酶进行详细分析的方法。对于Snyder来说，他希望自己的研究小组能开始构建酵母激酶组的精细图谱，其他研究小组的参与将非常重要。“这就是我们为何要将数据尽可能快地向科学界公布的原因，”他说：“可以肯定的是，前面还有很多工作要做，我认为只有这样才意味着事情真正开始运转起来。”

    注：夏雨译自2006年2月号的《自然-方法学》，版权为英国NPG出版集团所有。更多信息请访问：http://www.natureasia.com/ch/naturemethods