两大实验室角逐 谁是蛋白技术高手？

两大实验室角逐 谁是蛋白技术高手？

　　

【编者按】：为了鼓励更多的优秀论文在国内的核心刊物发表以及鼓励和发掘极具潜力的青年科学家，表彰优秀的实验成果，国内的一些知名核心期刊、生物产品厂家与生物通联合举办了中国05-06生命科技年度优秀论文评选活动。此次评选活动已经进入了决赛阶段，最后“万”元大奖的获得者将从50多篇文章中诞生，这些文章都是由国内颇具实力的实验室完成，其中包含了同一领域研究内容，从实验设计到方法运用到底谁会胜出呢？以下是生物通个家意见，仅为评论，不做依据。

候选优秀论文：

《遗传学报》——

应用蛋白截短技术检测APC基因胚系突变  [投本文一票] 

《遗传》——

染色质免疫沉淀技术在研究DNA与蛋白质相互作用中的应用  [投本文一票] 

　

[文章简介]

应用蛋白截短技术检测APC基因胚系突变 

实验室：南京大学医学院遗传学实验室（刘晓蓉，王亚平）

东南大学医学院遗传学研究中心（刘晓蓉，单祥年）

德国波恩大学人类遗传学研究所（Friedl W3 ，Uhlhaas S，Propping P） 

江苏省肿瘤防治研究所分子生物学研究室（李金田，王亚平）

通讯作者：王亚平（简介见后）

资助项目：江苏省卫生厅重点研究项目（编号：H200207），江苏省应用基础项目（编号：BJ98078）

文章介绍：这一文章建立了蛋白截短检测技术，分析家族性腺瘤样息肉病（familial adenomatous polyposis, FAP）发病相关基因APC基因的胚系突变，研究基因正常突变型与结肠腺瘤样息肉病基因（adenomatous polyposis coli, FAP）疾病表型的关系。经临床诊断的22例FAP患者及43例散发性大肠癌患者，分别取外周静脉血和结肠粘膜组织，常规提取基因组DNA。应用蛋白截短检测技术（protein truncation test, PTT），分段分析APC基因巨大的第15外显子，对检出截短蛋白的样本进行测序，以确定突变位点及突变性质。22例FAP患者中，5例患者存在APC基因第15外显子的胚系突变，均为碱基缺失造成的移码突变，导致截短蛋白的产生；43例散发性大肠癌患者中未检测到APC基因第15外显子的胚系突变。蛋白截短检测技术是一种高效的基因突变分析技术，适用于大片段基因（如APC基因第15外显子）截短型突变的检测，可作为FAP症状出现前的常规基因诊断技术的一项有效补充。

　染色质免疫沉淀技术在研究DNA与蛋白质相互作用中的应用

实验室：南开大学分子生物学研究所，教育部生物活性材料重点实验室（王春雨, 石建党, 朱 彦, 张 琚）

美国塔芙茨大学医学院圣伊丽莎白医学中心心血管研究所分子生理学实验室（朱 彦）

通讯作者： 张 琚（简介见后）

资助项目：国家自然科学基金资助项目（编号：30471733，30271297)，留学人员短期回国工作讲学项目（“两个基地”项目编号：30410403237），2002年度高等学校博士学科点专项科研基金（编号：20020055026）

摘要：在后基因组时代，DNA-蛋白质的相互作用是研究基因表达调控的一个重要领域。与其他方法相比，染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）是一种在体内研究DNA-蛋白质相互作用的理想的方法。近年来这种方法与DNA芯片和分子克隆技术相结合，可用于高通量的筛选已知蛋白因子的未知DNA靶点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况，这将有助于深入理解DNA-蛋白质相互作用的调控网络。总结了染色质免疫沉淀技术的方法，特别介绍了使用这些方法取得的最新进展。 

[研究内容&技术方法PK]

1.蛋白截短检测技术

当基因发生移码或无义突变，使基因产物出现截短的多肽，即所谓的截短型突变。这种多肽并不能行使蛋白功能。蛋白截短检测技术（protein truncation test, PTT）是分析此类突变的一项高通量技术。《应用蛋白截短技术检测APC基因胚系突变》采用的就是PTT技术。

其大概的操作步骤如下图所示：

　

a.从组织和血液样本中提取基因组。真核生物普遍存在外显子结构，如本文根据经验基因的第15个外显子突变率较高，则对第15个外显子进行PCR。也可进行RT-PCR转录出cDNA。

b.在PCR时加入T7启动子，对产物直接进行体外转录\翻译反应。

c.对PCR产物进行测序和体外表达蛋白产物进行SDS-PAGE，检测是否突变。

2. 染色质免疫沉淀技术

我们知道可以利用Sourthern Blot研究DNA与DNA之间的作用，利用Western Blot研究蛋白之间的作用，利用Northern Blot研究RNA与DNA间的作用。那么DNA与蛋白的结合也是相当稳定，研究这两者间相互作用的实验技术称之为什么呢？首先，要声名一下反正不是叫Eastern Blot。

研究DNA与蛋白质相互作用的常见的方法主要有电泳迁移率变动分析（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）,DNaseⅠ足纹法（DNaseⅠfootprinting），酵母单杂交系统（Yeast One-Hybrid System）等；另外，生物信息学的方法也可以预测DNA上的转录因子结合位点的保守（consensus）序列。这些方法的应用大大促进了该领域的研究，但它们都有一定的局限性，不足以充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用的真实情况。

染色质免疫沉淀技术是一种在体内研究DNA和蛋白质相互作用的方法。它的发明最早可以追溯到20世纪60年代，早期曾多用于研究核小体上的DNA和组蛋白的相互作用以及组蛋白的修饰。近年来，此技术经过不断的发展和完善，特别是与DNA芯片和分子克隆技术相结合，可用于高通量的筛选已知蛋白因子的未知DNA靶点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况。该技术在国外已经得到了广泛的应用，安捷伦公司推出有ChIP-on-chip平台，Active Motif公司最近也推出相关试剂盒。也有一些科学家已经利用此技术做出不错的科研成果，比如在之前生物通报道的来自美国犹他州大学的华人科学家张海英研究酵母中一种出现频率较少的组蛋白Htz1时，就使用此技术研究Htz1与酵母基因组中启动子结合的偏好性，文章发表在Cell上。但是，这种技术在国内还鲜有报道。

这项技术流程示意图如下：

（生物通：张迪）

附：
王亚平 

1956年9月出生，医学博士,南京大学医学遗传学教授，博士生导师 

主要研究方向 医学遗传学、肿瘤遗传学 

主要研究成果：

->错配修复基因 hMLH1 Val384Asp的发现、存在状况及在消化道肿瘤发病中的作用。
-> 遗传性、家族性胃肠肿瘤发病相关基因分析与基因诊断系统的建立。
-> Wang YP, et al. Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer: Frequent Occurrence of Large deletions in MSH2 and MLH1 genes. Int J Cancer, 2003, 103636-641. 
-> Wang YP，et al. A Modified Multiplex PCR Assay for Detection of Large Deletions in MSH2 and MLH1 Genes. Hum Mutat，2002，19:279―286. 

张琚 

所在院系: 生命科学学院 
主要职务: 南开大学分子生物学研究所研究员、博士生导师。
现兼任生命科学学院生物化学与分子生物学系主任、分子生物学研究所所长。

学术兼职：
1、天津市生物医学工程理事会理事
2、《国外医学医学分子生物学分册》特邀审稿专家
3、《中华中西医杂志》常务编委
4、《中华现代外科学杂志》常务编委 

简历: 
1978-1982南开大学生物化学专业学士、硕士。1989.5-1994.1在奥地利因斯布鲁克大学生物化学所读博士学位，1994.1获奥地利理学博士学位。1994.1-1996.1在奥地利因斯布鲁克大学泌尿医院前列腺研究中心作博士后，1996年回国，创建了医学分子生物学研究室。

研究成果: 
在雌激素对前列腺增生基质病变作用的分子机制方面取得了一系列重要的研究成果，在体外首次成功的培养了前列腺的平滑肌细胞，为前列腺基质增生病因及治疗药物的研究奠定了基础。提出并初步证实了“体外培养的前列腺基质细胞即成纤维细胞和平滑肌细胞间可进行分化与逆分化”的理论和基质细胞（成纤维细胞和平滑肌细胞）比例的稳态失衡是前列腺基质增生诱因之一的研究假说。自1995年以来就前列腺研究领域在国内外杂志上发表了70余篇学术论文，其中被SCI.收录11篇，他人引用180余次。1996年以来，作为申请人先后获得8项国家级、5项天津市、3项国际合作等共计15项基金的资助，总经费达200余万元。 

获奖情况: 2000年获得教育部“跨世纪优秀人才”称号，2001年被聘为南开大学特聘教授。