实时定量PCR的五个问题

【字体: 时间:2006年12月20日 来源:生物通

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  生物通报道:实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,QPCR)技术使mRNA定量、基因分型(genotyping)和微列阵数据检验变得简单智能。但是“简单”也只不过是赞美,真正进行QPCR时,其中的缺陷接踵而来。以下是QPCR专家就五个常见问题进行的探讨。

  

生物通报道:实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,QPCR)技术使mRNA定量、基因分型(genotyping)和微列阵数据检验变得简单智能。但是“简单”也只不过是赞美,真正进行QPCR时,其中的缺陷接踵而来。引物和探针设计、样本制备和选择控制(control selection)标准化都是一些潜在的障碍。修斯顿Texas大学保健科学中心Quantitative Genomics核心实验室主任Greg Shipl说,“需要进行许多虚拟工作”,从确定靶基因是否有突变到保证靶基因的特异性。


1 标准是否符合实际?


I-Hsiung Brandon Chen以前在加州Scripps研究所,利用罗氏LightCycler 2.0和SYBR Green chemistry,建立RT-QPCR分析技术,验证DNA芯片收集的基因表达分析资料。Chen 说:“在实现标准化的过程中,我认为最常见的问题是选择对所有基因进行规范化的最佳内参基因。我需要进行六次检测,才能筛选出1个或2个比较稳定的(内参基因),其它4个会随着处理发生变化。” 目前还没有设计内参的标准。怎样选择符合实际的内参?


不幸的是反复实验以内参为标准,宾州大学Huck研究所生命科学核酸设备研究计划主任Deborah Grove说。对每个经过处理的样本的一部分进行检测,观察预期表达稳定的转录本(如看家基因GAPDH或者beta-actin),如果确实是稳定的,即相对于添加的RNA量而言,QPCR测量的转录本含量在所有样本中都恒定,那么这种内参是成功的,如果不是则还需继续寻找。爱荷华州立大学DNA facility主任Kevin Knudtson认为,即使有一种标准化内参,还是不够的,“至少有两个评价指标,才会对规范有效有更多的信心。”


2 RNA降解了吗?


密歇根大学医学院分子和行为神经科学研究所的研究人员Ilan Kerman,希望利用QPCR确认微列阵来源的基因表达的变化情况。Kerman的样本是人脑mRNA(采自于激光微分离出的一小部分细胞),不尽如人意。一些RNA提取于脑死亡和获取组织后的20到25小时内,RNA通常在这个时间段发生降解。“我们知道它们比常规手段处死的小鼠的RNA降解的要快。”另外, Kerman需要核实的基因表达量的变化范围为20-90%。


Toledo大学医学生理学博士James Willey认为,Kerman遇到的问题有两个:RNA降解和RNA含量太低。“就对RNA质量的要求而言,QPCR比其它现有的基因表达检测方法要低。”Willey在一封电子邮件中写道,“特别是设计小片段PCR扩增子(比如,不到150bp)”。另外,不同的基因降解速率不同。


Willey建议首先在凝胶中检测RNA的质量。“跑总RNA的电泳,如果两种核糖体条带能够完全分开,或者RNA完整值(RNA integrity number,RIN)很高(与安捷伦描述的一样),有可能得到可信的QPCR结果。如果不出现任何核糖体条带,或者RIN很低,为样本质量确立基因特异性标准就很必要。”至于RNA数量,他认为利用低量模板,随机采样误差会引起扩增循环数(cycle threshold,Ct)值出现大的变动。“高扩增循环数(比如,34或者35以上)有许多潜在原因,”比如低模板数和基因特异的抑制剂。区分这两个原因,他建议在每次分析过程中,加入一定数量的内参分子。


3 怎样检测低拷贝数模板?


爱荷华州立大学博士后Jill Petrisko,利用TaqMan chemistry和Cepheid SmartCycler II对大米真菌感染进行定量,准备时间花了数月。Petrisko说: “我遇到的一个问题是实验使用的是单拷贝基因。在线性的实验过程中,检测真菌DNA真的很困难。”为了将循环数限制在20-30,她首先溶解、浓缩DNA以提高反应的模板量,问题虽然解决了,但reproducibility随之降低。最终,她更换了引物,检测多拷贝靶标。


“对于低拷贝量的样本,我拭图增加拷贝量,”Knudtson说,或者通过延长逆转录酶作用的时间(扩增mRNA时),或者通过加大反应体积。“许多试剂盒的反应体积都是50ml,”Knudtson说,许多研究人员为了节省成本,使用20-25ml体积,“但如果保持50ml甚至100ml,会添加更多的模板”当然会增加花费,Knudtson说:大体积出产高质量。


4 阴性结果真的是阴性结果吗?


加拿大食品安全检验局分子生物学家Margaret Green利用罗氏LightCycler 1.5和TaqMan 、SYBR Green chemistries,对DNA进行QPCR。“我正在利用发展中的检测技术,对各种靶标进行检测,”Green说在一间诊断实验室里,将低拷贝的阳性样本从真正的阴性样本中区别出来非常重要。“如果一个样本的新Ct值(比如大于37),能说明它是阴性的吗?”


Shipley在一封电子邮件中写到:“对于我来说,Ct37或以上,是不信的,因为这比一个模板分子的误差还要小。”100 bp的单拷贝扩增子经过35、36个循环可以检测到,预期化验经过几个几乎完美的斜率(slope),可以转变为几乎100%的PCR效果。(随着斜率上升,Ct值也会增长,他强调说)。“考虑到这个问题,寻找这些值以下的阳性结果是没有意义的。”Grove建议上调反应模板,进行非模板的对照反应。


5 有抑制剂怎么办?


爱荷华州立大学微生物副教授Malcolm Shields,利用QPCR检测、估计环境样本中的细菌种类。Shields说:利用MJ Research Chromo4系统和SYBR Green chemistry“我们准备对一些粗样——污水进行QPCR。” Shields遇到的麻烦是抑制剂,比如与核酸聚集在一起的腐殖酸和棕黄酸碳水化合物衍生物,以及蛋白酶、去垢剂等。他的解决办法是:尽量提纯DNA,利用spike-in对照突出抑制。


纽约Trudeau研究所分子生物中心设备主任Pamela Scott Adams说,“如果你运行一条标准曲线(并且)得到100%的有效性,那么斜率是-3.3,”如果斜率提示大于100%有效性,那么说明实验中出现抑制。


“有许多好的商业化试管排除了抑制剂,”Willey说,“当我们分析人类组织时,我们传统方法是用(phenol-based)TRI试剂提取,并放入试管(比如,Qiagen的)。我们发现PAX试管对于血液样本不错。”由爱荷华州立大学Jack Gallup研制的PREQXCEL,也是一个优秀的系统,适合于设计缩小抑制现象的反应步骤。(生物通记者 小粥)

 

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