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分子生物学实验手段改进 三篇文章谁是操作高手？
【字体： 大 中 小 】 时间：2006年11月27日 来源：生物通
编辑推荐：
分子生物学实验手段改进 三篇文章谁是操作高手？
【编者按】：为了鼓励更多的优秀论文在国内的核心刊物发表以及鼓励和发掘极具潜力的青年科学家，表彰优秀的实验成果，国内的一些知名核心期刊、生物产品厂家与生物通联合举办了中国05-06生命科技年度优秀论文评选活动。此次评选活动已经进入了决赛阶段，最后“万”元大奖的获得者将从50多篇文章中诞生，这些文章都是由国内颇具实力的实验室完成，其中包含了同一领域研究内容，从实验设计到方法运用到底谁会胜出呢？以下是生物通个家意见，仅为评论，不做依据。
候选优秀论文：
《遗传》——
炭疽毒素受体ATR cDNA的合成和克隆及ATRFc融合蛋白的真核表达载体的构建 [投本文一票]
[文章简介]
实验室：湖北大学生命科学院分子微生物与基因工程实验室，宜春学院生物工程系（陆云华，马立新，蒋思婧）
基金项目：国家863计划(国家高技术研究发展计划项目)(编号2002AA227011)和湖北省自然科学基金(编号:2003ABA118)
摘要：文章报道了一种简便、通用、高效的复杂载体构建方法。此法是在PCR引物设计时，在目的片段5′端加上随机设计的接头，利用PCR克隆目的片段，再用T4 DNA聚合酶3′→5′外切酶活性处理PCR克隆目的片段，产生多个首尾相匹配的粘性末端，进行多片段定向连接、转化、重组子鉴定。以7片段拼接的水稻单交换质体定点整合表达载体pRSMGA的构建为例，应用上述方法构建只需做两次连接、转化且其重组、转化效率高。数10次实验证明：这是一种简便、通用、高效的复杂构建载体的方法，该法至今尚未见报道。
实验室：四川大学生命科学学院（张容，郑彦峰，吴瑶，王胜华，陈放）
基金项目：国家自然科学基金(编号:30270090)和四川大学科研启动基金资助项目
摘要：在提取缓冲液中加入皂土有效地去除了蛋白质并抑制RNAse，建立了一种高效的植物RNA提取方法。以麻疯树幼叶为材料，分别用TRIZOL，异硫氰酸胍法，SDS-KAc法和新创皂土法提取总RNA进行比较和验证，琼脂糖凝胶电泳和紫外光谱分析结果表明，只有皂土法能提出质量高，完整性好的RNA。进一步以皂土法提取的18S rRNA为模板的RT－PCR结果分析表明， 用该法提取的RNA 能用于分子克隆与基因表达分析等后继分子生物学实验。该方法简便，快速，不失为一种经济高效的RNA提取方法。
炭疽毒素受体ATR cDNA的合成和克隆及ATRFc融合蛋白的真核表达载体的构建
实验室：军事医学科学院生物工程研究所（胡显文，高丽华，陈薇，徐俊杰，赵剑，陈惠鹏）
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30300016）
摘要：可溶性炭疽毒素受体（sATR）可以特异性结合炭疽毒素保护抗原（PA），为获得用于中和炭疽毒素以防治炭疽感染的候选抗毒素药物，构建了表达ATRFc抗体样分子融合蛋白的真核表达载体。将全长为681bp 的编码炭疽毒素受体N端1~227氨基酸的基因分成长约50~60碱基的18个寡核苷酸片段，相邻片段重叠部分为20~22个碱基，利用重叠延伸PCR和引物PCR法，将合成的片段组装与扩增，得到了含有ATR1~227的全部编码区和Hind III、BamH I位点在内的DNA片段。回收的基因片段经BamH I/Hind III双酶切连接到pUC19质粒中，挑选阳性克隆进行酶切鉴定和双向序列测定，获得了全序列正确的克隆。将ATR基因与Fc基因连接后插入pcDNA3.1载体多克隆位点Hind III和Not I之间，得到表达ATRFc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1/ATRFc，为利用CHO哺乳动物细胞表达ATRFc并研究其生物学性质奠定了基础。
[研究内容&技术方法PK]
这三篇文章均集中在分子生物学技术手段改进方面，一种通用高效的复杂载体构建的新方法报道的是一种复杂载体的构建方法；一种简单有效的植物RNA提取方法则是在抑制RNAse方面提出了一种新方法； 炭疽毒素受体ATR cDNA的合成和克隆及ATRFc融合蛋白的真核表达载体的构建是特殊真核生物载体的构建。
虽然这几种方法并不一定就是非常先进或者革新性的技术手段改进，但是在具体的分子生物学操作方面解决了一些具体的问题。
载体构建技术是分子生物学和基因工程研究中的常用技术之一，传统的载体构建方法在构建多片段拼接的复杂的载体时往往设计，操作较麻烦，通常要构建多个中间载体，需要多次连接、转化。在一种通用高效的复杂载体构建的新方法研究报告中主要解决的是复杂载体构建的问题，利用T4 DNA聚合酶3′→5′外切酶活性完成了水稻单交换质体定点整合表达载体pRSMGA的构建，见下图
而一种简单有效的植物RNA提取方法这一研究报告发现在提取缓冲液里加入皂土（Bentonite）可以减少后期酚/氯仿抽提的次数，从而降低了的RNA损耗，缩短了实验时间，并且还能有效的抑制RNA，这主要是因为皂土具有吸附蛋白质及有效抑制RNAse的特性。
另外文章也提出在沉淀之前加入1/2体积的5mol/L KAc(pH 4.8)有利于去除样品中的多糖，提高样品的质量，而沉淀使用乙二醇丁醚代替传统的异丙醇和无水乙醇能有效的去除样品中的多酚类物质，50%的高浓度乙二醇丁醚可沉淀RNA，并使多酚溶于乙二醇丁醚而被除去。这些都是在具体实验操作过程中可以借鉴的方法。
（生物通：张迪）
