上海肿瘤研究所973项目获方法突破

　　

生物通报道：来自上海交通大学肿瘤研究所，上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室（Key Laboratory of Oncogenes and Related Genes）的研究人员就噬菌体研究方法过程的一个难题提出了解决方法，为噬菌体展示技术，噬菌体基因传递（phage gene delivery）和抗原制备（antigen preparation）等实验手段的改进提供了重要资料。这一研究成果即将公布在12月的《BioTechniques》上。

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领导这一研究的是来自上海交通大学肿瘤研究所，上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室的顾健人院士，这一研究项目得到973项目（no. 2004CB518802）和上海科技基金项目（no. 054119568）的资助。

原文摘要：
BioTechniques® December 2006
Volume 41, Number 6
Cell-targeted phagemid particles preparation using Escherichia coli bearing ligand-pIII encoding helper phage genome [Full text]（免费全文）

丝状噬菌体M13、fd和f1是一种在噬菌体展示，噬菌体基因传递和抗原制备等生物技术研究手段中应用广泛的噬菌体——这主要是由于这些噬菌体在增殖期间均不裂解宿主菌，极大地简化了每轮淘选过程之间的中间噬菌体纯化步骤，只用简单的PEG沉淀方法就足以将噬菌体与其他所有污染的细胞蛋白分开。

在之前的研究中，顾教授等人针对噬菌粒（phagemid）介导的基因传递方法报道过改进的辅助噬菌体M13KO7P1（编码12-mer配体多肽和pIII蛋白（pIII fusion））可以用于获得编码兴趣基因的噬菌粒，这种噬菌粒可以展示高水平多肽，而且对于pIII编码蛋白也不是必需的，因此可以给目标基因留下更大的空间。

由于噬菌粒的大小是与克隆的目的基因成比例的，因此当然希望能进一步改进噬菌粒，增大其承载量。但是M13KO7P1辅助噬菌体的得率是比较低的：3.4 × 10⁹ plaque-forming units (pfu)/mL，当辅助噬菌体修饰配体大小中等，比如表皮生长因子EGF，那么得率就很低。为了解决这个难题，顾教授等人通过将EGF修饰辅助噬菌体基因组转入F⁺细菌细胞，获得LMP细胞，这样编码目的基因的噬菌粒就可以转入LMP细胞。

这种方法可以非常方便的制备高水平配体展示的噬菌粒。目前已知携带噬菌体载体的单链基因组复制的低效性会导致哺乳动物细胞的低表达，就这一方面已经发展出了一些方法来克服，比如利用腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）终端重复序列(inverted terminal repeat,ITR)加强单链基因组复制。现在顾教授等人提出的LMP细胞，可以有效的包装带有ITR的噬菌粒，而且这种更小体积的噬菌粒也许也可以用在体内基因转移上。
（生物通：张迪）

附：
顾健人简介

中国工程院院士顾健人

顾健人教授，肿瘤分子生物学专家，1932年1月生。上海交通大学医学院教授，上海交通大学肿瘤研究所研究员、名誉所长，癌基因及相关基因国家重点实验室学术委员会主任，博士生导师。1994年当选为中国工程院院士，现任中国工程　院主席团成员。

1954年毕业于原上海第一医学院。1979-1981年英国Beatson肿瘤研究所访问学者。1986－1995年美国国立卫生研究院LMO科学顾问。1995年－1999年任美国General Motors 癌症基金委员会评奖委员会委员。

近五十年来，先后从事肿瘤病理、肿瘤生物化学、肿瘤分子生物学及肿瘤基因治疗研究。在国际上首次发现了肝癌的活化癌基因谱，获国家科技进步二等奖、卫生部科技进步一等奖。发现了在染色体17p13.3存在高频率缺失，证明了人寽DNA LOH最高频率的区段。1998年起，主持了以细胞生长为基础的高通量功能基因筛选，发现了300余个具有抑或促进细胞生长的新基因全长cDNA,已全申请国家专利，对肿瘤的功能基因组学研究作出了贡献。首选在国内开展恶性脑瘤的基因治疗临床试验，是我国第一个经药审批准进入临床的肿瘤基因治疗方案。创建了以受体为靶向的非病毒基因导入系统，已获美国专利。

曾荣获上海市首届科技功臣、僵卫生系统模范工作者、全国“五一”劳动奖章、上海市医学荣誉奖、1997年何梁何利科技进步奖等。

顾健人综述文章《医学生物高技术及其产业》

生物高技术的基本概念

1.生物高技术是当代产业革命的重要组成部分

生物高技术是以分子遗传学的知识，应用各种现代技术，尤其是针对基因进行操作、改造和转移的技术，获得人类所需要的蛋白用以防治疾病；改造动植物的品种；用基因来防治农作物的病虫害；用基因或细胞来治疗人的疾病等。它是农业、医药工业产品的更新换代的重要技术。因此，生物高技术是当代产业革命的重要组成部分，是一次生产力解放的重要基石。

生物高技术涉及医、药和农业。本文仅就与医药相关的生物高技术作一简单介绍。

2.什么是基因

基因是一种遗传物质。它的物质基础是脱氧核糖核酸（DNA），由两条DNA链形成双螺旋结构。DNA是由脱氧核苷酸连接而成单链。一个基因的DNA所含的核苷酸数目可多达数千至上百万。但是，核苷酸只有四种，即A、T、G、C。由于上千成万的核苷酸可由ATGC按不同的顺序排列，这种排列的顺序，叫做“序列”。虽然核苷酸仅有四种，但是长达成千上万个核苷酸所组成的DNA，可以排列出不知多少种的序列。不同的序列，组成了不同基因。

为什么基因的核苷酸序列会组成不同基因？因为基因的DNA序列，储存了“密码”：即每三个脱氧核酸决定一个氨基酸。核苷酸的序列如果是ATG，它决定的氨基酸是甲硫氨酸，ATT是异亮氨酸，ACT是苏氨酸，TAC是酪氨酸，TTT是苯丙氨酸……不同的核苷酸的序列，可以编码20种氨基酸。不同的基因，有不同的DNA序列，可编码不同序列的氨基酸所组成的多肽，这就是基因的遗传密码的奥秘。

人体应该有10万基因，理论上可以编码10万个蛋白。现在已经知道结构和功能的基因仅数千个（小于7000个），因此还不到10％。所以说，人虽然可以遨游太空，但对人本身的了解还仅仅是开始。

3.什么叫“基因表达”

如果说，你感到基因还是一样看不到或摸不着的东西，那么它最终形成的蛋白，则是与人们生命活动密切相关而且可测可知的东西了。而且用基因制造的药物已经上市。

基因是DNA，它怎样会制造出蛋白？原来基因是两股DNA链的双螺旋结构所组成，它在行使它的功能前，先要解开，暴露出单链，其中一条是有功能的链，叫做正链。这条DNA链，可以通过一群酶的作用下，按它的核苷酸（A、T、G、C）的序列，合成一条RNA互补链。这条RNA链（由A、U、G、C）四种核苷酸所组成，它的序列恰好和DNA链的核苷酸序列“互补”。如果DNA上是AGCTCCG……根据核苷酸的配对原则，（A→U，T→A，G→C，C→G），RNA上的相应序列是UC－GAGGC……这样，把DNA上包含的“信息”传递到它对应的RNA链上去，而且是精确无误。这个过程，正像一盘磁带用录音机录到另一盘空白磁带上去，我们叫它为“转录”，唯一不同的是，母带上的信息是DNA，子带上信息已转为RNA，但是它携带的信息依然是正确无误。

那么，蛋白又从哪里来呢？原来RNA上所持有的信息，通过三个核苷酸决定一个氨基酸的原则，通过细胞质里一套“机器”可以把RNA的序列，翻译成按一定的氨基酸序列排列的多肽。

这样，基因（DNA），通过“转录”成RNA，最后由RNA“翻译”成蛋白。基因通过转录、翻译最后生产出蛋白，这个全过程称为“基因表达”。而基因表达的最终产物是蛋白。人之所以能生长发育、健康生活，正是靠多少万个基因在表达它各自的蛋白。人没有血红蛋白，就不能生存，所以，血红蛋白的基因（珠蛋白基因）先天出了毛病，就成为遗传病。现在知道，恶性肿瘤、高血压、糖尿病以至老年痴呆都是基因发生了故障，但是，有多少个基因以及是那一种基因出了故障还不清楚。可能在下个世纪初，这些基因将被全部搞清，这将标志医学历史上的一次重大革命。

4.什么是基因工程

基因工程的道理很简单，就是把基因的编码序列放进一个“载体”中，加上启动基因表达（启动子）和增强它表达的元件（增强子）以及表达的终止元件，组成一个“重组体”。我们把它称为某个基因的表达载体。然后，把它放进细胞中去，让它生产出所要的蛋白。

根据组成这种表达载体中的元件不同，这种重组体可以在细菌如大肠杆菌中表达，也可在酵母或哺乳动物细胞中表达。

5.什么是基因治疗

基因工程是把基因放进“体外”的系统，在细胞中表达出蛋白，经分离纯化后作为一种药物。基因治疗则是把基因直接导入人体或先导入人的细胞然后输入人体，让这种基因达到治病的目的。这虽然很诱人，但是技术上还不够成熟，目前尚在起步阶段，必须在严格控制下，经国家卫生部药政局批准后才能进行临床试验。

6.什么是转基因动物

转基因动物，是把基因的表达载体直接注入受精卵或早期的胚胎细胞，然后植入假怀孕的母体动物，经植床后发育成胎，最后成熟分娩，产出带有该基因的动物。例如，把乙肝病毒（HBV）全基因的载体注入小鼠受精卵，可产生全部细胞带有乙肝病毒基因，并能在肝脏产生乙肝病毒的小鼠。近几年来，转基因动物，已进一步发展成有目的地将某一个或某一组基因去除（Knock out）的技术。这可制造出某种基因缺陷的动物，确定该基因在机体发育和维持生命中所起的作用。

转基因动物的另一种技术，是将某种基因的表达载体（必须带有特定的启动子和增强子）注入受精卵或直接导入牛或羊的乳腺，从而让动物从乳汁中分泌我们所需要的药物。这称为“生物反应器”，代替了体外的发酵罐。这也是今后将发挥重要作用的“体内”基因工程。

近年来，英国已将特定的抑制机体排阻反应的相关基因培育转基因猪，用于器官移植，最近已进入黑猩猩体内试验。该实验若能成功，将标志脏器移植史的重要里程碑。