陕西刘晖博士干细胞体外培养获成功

　　

生物通综合：据中国医药消息，武警陕西总队医院刘晖博士等在完成的一项国家自然科学基金资助课题中，采用体外研究的方法，成功地从鼠胚胎中培养出听囊细胞（即毛细胞前体细胞）。这一结果，为研究刺激听觉毛细胞再生的治疗提供了新思路和新方法。　　据介绍，由噪声、耳毒性药物等引起的耳蜗毛细胞损害而致的感音神经性耳聋，是耳鼻喉科的难治之症。因此，建立一种既具有分化听觉毛细胞潜能，有利于听力研究，又有利于进行药物开发及毛细胞生物力学研究的细胞系，已成为科研人员关注的热点。

　　为探索这一课题的新方法，刘晖等研究人员采用体外培养的方法，选取胎龄14天小鼠胚胎中的听囊细胞进行传代培养研究。他们将听囊细胞进行组织碎剪、消化、吹打、孵育和细胞融合等一系列技术处理，以及历时4个月8代传代培养后，终于成功地培养出一种新型的“胎鼠听囊细胞”。

　　该听囊细胞经用免疫细胞化学法进行细胞角蛋白、F-肌动蛋白及染色等检测，结果发现：新培养的听囊细胞呈现上皮细胞、成纤维细胞和神经细胞3种形态；细胞角蛋白和F-肌动蛋白标志染色呈阳性，在原代培养出现calretinin染色阳性的细胞，传代后检测仍为阳性；BrdU染色显示，传代细胞有丝分裂存在，具有明显的增殖活性，可分化或增殖为未成熟的毛细胞。

 

以下为该课题组在《第四军医大学学报》上发表的相关论文的摘录:img src="

---

"

胎鼠听囊细胞体外培养研究

2006 年 7 月 第 26 卷 第 14 期

【摘要】 目的： 了解哺乳动物听觉细胞的来源，探索听觉细胞前体细胞体外增殖和分化. 方法： 取孕鼠胚胎听囊细胞进行体外培养，用免疫细胞化学方法，分别对培养的细胞进行细胞角蛋白、F肌动蛋白和calretinin染色观察细胞特征；BrdU染色观察细胞增殖. 结果：培养的细胞在体外进行分化和增殖，细胞形态主要有上皮细胞形态、成纤维细胞形态和神经细胞形态3种. 对细胞角蛋白和F肌动蛋白这两种上皮细胞的标志染色呈阳性. 在原代培养就出现calretinin染色明显阳性的细胞. 传代后结果仍为阳性着染，但强度减弱. BrdU染色显示培养细胞具有明显的增殖活性. 本研究共传8代，历时4 mo，细胞形态维持稳定. 结论： 胎鼠听囊细胞在体外自然培养条件下可以分化或者增殖为未成熟毛细胞. 本研究为探索刺激听觉毛细胞再生的治疗方法提供研究思路和方法.

讨论

    有关毛细胞再生的研究已经进行了10余年. 目前，普遍的观点认为，鱼类和两栖类动物耳内终生都有毛细胞的产生，尤其是鸟类的前庭器官，有损伤后自我修复的功能. 哺乳动物毛细胞在出生后就已经停止增殖，不可能再产生. 近年来的许多研究成果令人鼓舞，已证实哺乳动物毛细胞的再生能力，但这些现象大部分是在自然恢复的过程中观察，急需探明毛细胞增殖和分化的来源. 大部分小鼠胚胎期听囊细胞进行终末有丝分裂是在胚胎15 d左右，经过终末有丝分裂后分化为毛细胞. 本研究的目标为在胚胎期听囊细胞进行终末有丝分裂之前，取出听囊（胚胎14 d），观察并培养听囊细胞，即毛细胞的前体细胞，从而了解这些前体细胞在体外自然培养条件下的增殖和分化情况.

    以往许多研究者应用H2kbtsA58转基因动物进行永生化细胞系建立的研究，但是由这种转基因动物建立的永生化毛细胞前体细胞系有一定的缺陷：首先，这种动物的基因发生了变化，很容易发生进一步的突变，从而限制了它们在分子基因和细胞再生方面的研究；其次，这种转基因动物建立的永生化细胞系不可避免的改变了细胞本身的一些特点. 正是基于以上原因，本实验选取胚胎14 d的鼠胚听囊上皮细胞进行体外自然培养，不带有任何转化基因. 细胞形态主要有上皮细胞形态、成纤维细胞形态和神经细胞形态，而且这种形态在细胞传代后基本维持稳定. 部分细胞在培养过程中形成了细胞克隆. 用免疫细胞化学方法进行细胞染色后发现，原代和传代细胞对上皮细胞标志F肌动蛋白和细胞角蛋白均表达阳性. 而早期毛细胞的标志calretinin在原代培养中表达强阳性，说明胚胎听囊细胞离体后可以直接分化为有具有毛细胞特征的细胞. 这一结果与新生鼠和成年鼠的毛细胞前体细胞研究中有相似的发现。

    干细胞的研究一直是近年研究的热点，在对哺乳动物毛细胞前体细胞的研究中，研究者也发现了一些干细胞存在的证据。 尤其是Li等的研究发现成年小鼠的前庭上皮中有一些表达干细胞标志的细胞，这些细胞可以分化为毛细胞样的细胞，具有替代丢失的毛细胞的潜能. Ito等的研究也证实神经干细胞可以适应耳蜗的内环境，表现出毛细胞的形态. 本研究在进行终末有丝分裂之前得到的前体细胞在体外的表现也有几个干细胞的特点： ①  可以增殖分裂，BrdU染色阳性也说明这些细胞处于有丝分裂过程中；②  有类似的细胞克隆出现；③  细胞可以分化为具有毛细胞特征的细胞. 虽然传代细胞仍然具有上皮细胞的特征，在对这些细胞进行calretinin染色后发现，细胞的阳性程度减弱. 所以，需要进一步的实验证实毛细胞干细胞的存在. 研究中培养的毛细胞前体细胞不但可以进行耳蜗基因方面的功能研究，也将为探索刺激听觉毛细胞再生的治疗方法提供研究思路和方法.