武汉大学等最新PNAS文章：基因重组新方法获研究突破

武汉大学等最新PNAS文章：基因重组新方法获研究突破

　　

生物通报道：来自美国罗切斯特大学（University of Rochester）病理学与泌尿学系，联合中国武汉大学中南医院（Zhongnan Hospital）泌尿科，台湾长庚大学医院（Chang Gung University Hospital）等处的研究人员利用一种组织特异性定点重组的方法：Cre/LoxP系统，就雄性激素受体的缺乏对睾丸细胞影响的分子生物学机制研究获得了新突破。这一研究成果公布在11月9日的《美国国家科学院院刊》（PNAS）杂志上。

文章第一作者为同属武汉大学和罗切斯特大学的张材夏（Caixia Zhang，音译），参予实验的还有武汉大学中南医院的胡礼泉，通讯作者为Chawnshang Chang。

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Published online before print November 9, 2006
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 10.1073/pnas.0608556103
Oligozoospermia with normal fertility in male mice lacking the androgen receptor in testis peritubular myoid cells 
[Abstract]

雄性激素（Androgen）和雄性激素受体（androgen receptor ，AR)在睾丸中扮演着重要的角色，之前的研究表明雄性全AR敲除小鼠精子细胞发育形成不完全，并且血清睾丸激素（serum testosterone）水平降低，从而导致了精子缺乏症（azoospermia）和不育症。但是具体的AR缺乏在特异的睾丸细胞中的作用至今尚不清楚。

在这篇研究报告中，研究人员利用Cre/LoxP系统（是一种对转入基因进行组织特异性、定点操作的基因重组系统，详细简介见下）获得了一个组织特异性敲除小鼠（PM-AR^-/y，睾丸管周收缩细胞(peritubular myoid cells)AR基因被敲除）。表型分析表明PM-AR^-/y小鼠与WT AR (AR^+/y)并无区别，但血清睾丸素浓度不同。另外PM-AR^-/y虽然附睾中精子数量稀少，但并没有不育症。

进一步的机制研究说明PM-AR^-/y在Sertoli细胞功能性标志基因的表达方面有缺陷（这些基因包括occludin, testin, nectin, zyxin, vinculin, laminin3, gelsolin, connection43和N-cadherin）。除此之外PM-AR^-/y管周收缩细胞收缩性相关基因（endothelin-1, endothelin receptor A and B, adrenomedullin, adrenomedullin receptor和vasopressin receptor 1a）也是缺陷性的。

这些研究都表明PM-AR^-/y小鼠是证明正常AR对于维持正常Sertoli细胞功能和管周收缩细胞收缩性重要性的体内证据。
（生物通：万纹）

附：
组织特异性定点重组Ｃre/LoxP系统的研究概况


摘要：Ｃre/LocP系统是一种对转入基因进行组织特异性、定点操作基因重组系统。可进行基因的定点整合、特定基因的组织特异性删除、基因的条件性重组、染色体易位等方面的研究，在小鼠的转基因方面已经开展了广泛深入的研究，并为我们建立了良好的实验动物模型，这对家畜转基因工作的开展开辟了一条全新途径。下面仅就Ｃre/LoxP系统的研究概况做简单介绍，希望能在转基因动物制备上得以借鉴。 

　　生物技术的飞速发展在国民经济中起着越来越重要的作用，它已经渗透到人类生活的各个领域，并取得了举足轻重的地位。而且转基因技术的出现为我们从分子水平了解生命现象、探讨生命本质、研究疾病发生机理等起到了巨大的推动作用。国内外在动物转基因技术方面均已开展了卓有成效的工作，其中小鼠转基因研究方面成就最大、发展最为迅速。

　　小鼠的转基因可以通过胚胎干细胞方法得以实现，而在家畜上则行不通。目前家畜的转基因主要是采用显微注射法进行转基因动物的制备，但当外源基因注入到胚胎雄原核内时，外源基因在基因组上的整合是随机的，其表达量受整合位点、基因拷贝数等因素的影响。通常带有转基因表型的小鼠可育或可高效表达，但高效表达的转基因在胚胎早期影响胚胎的发育，因此在转基因个体的筛选过程中表达量较低或出现翻译异常的个性往往被选中。另外有些转基因动物在达到性成熟前，外源基因的表达是有害的，因此需要一次一次地进行转基因动物的生产，特别是转入基因在胚胎早期为致死的。采用同源重组技术，用Ｎull基因替代目的基因，并制备成转基因纯合体，这种基因从出生到成年替换掉的基因均不能进行表达，观察不到效果；这种基因缺失有可能又是致死的。为了克服这些问题，迫使人们寻找一种能定点进行基因插入、控制转入基因的拷贝数、可进行组织特异性表达、按照人们的意愿定时对目的基因进行表达启动与关闭。尽管目前关于条件性调控表达载体较多，但均满足不了上述要求。最近，美国＂杜邦＂公司发明了一种组织特异性、定点重组Cre/LoxP系统 ，其在转基因中的诸多优势引起了学术界和商界的极大关注，美国许多转基因动物公司如Lexicon、Tacnic等纷纷采用该重组系统进行转基因动物生产与研。Jackson实验室宣称将建立转有可在不同组织表达Cre重组酶的转基因小鼠文库，以便进行双转基因小鼠的制备，用于对转入基因表达的调节控制。 

1　Cre/LoxP重组系统的发现 

　　噬菌体Ｐ1在大肠杆菌内处于溶源状态时是以单拷贝形式整合在宿主菌基因组上的，它编码一个位点特异性重组系统。这个系统包含一个ＬoxP位点和一个称为Ｃre的基因，该系统负责将噬菌体整合到或脱离宿主菌基因组。其另一个主要作用是降低基因组内外源基因的拷贝数，直至一个拷贝为止；同时还有助于在感染组织中使Ｐ1ＤＮＡ环化，以及ＤＮＡ复制后形成的二聚体的分离，保证噬菌体子代在细胞分裂时只有一个Ｐ1的存在，但具有机制不详。 

　　Ｃre重组酶以高效方式进行组织特异性、位点特异性和可遗传方式对基因组ＤＮＡ进行重组。Cre和ＦＬＰ（也是一种重组酶，其作用的位点是ＦＲＴ）相似，不含有核定位信号，可能是通过融合或有丝分裂时核膜破裂进入核内，所重组的ＤＮＡ长度一般为20kb，有时可达70kb以上。目前已经取得到了Cre蛋白，它在真核细胞内也可以发挥良好的ＤＮＡ重组作用。

2　Cre重组酶结构 

　　Cre重组酶是整合酶家族的一员，它是从噬菌体Ｐ1中提取出来的。整合酶识别特定的核苷酸序列，通过ＤＮＡ和蛋白质的瞬间结合，发挥其重组作用。依据序列同源性，来自细菌和酵母的重组酶可以分为整合酶家族和解离酶－转化酶家族。这两个家族采用两个截然不同的重组机制，但均是通过酪氨酸残基与靶ＤＮＡ共价组合，借助一系列标定剪切位点裂解ＤＮＡ底物。

　　大于60个成员的重组酶家族成员间除4个用于催化反应的严格保守的残基外，其余的序列同源性较差。这种非同源反映了重组酶在遗传重组时功能和形式的多样性。Cre活性区包含保守的催化三联体残基，精氨酸173、组氨酸289、精氨酸292，还有保守的亲核酪氨酸324和色氨酸315。 

　　Cre是一个38kD的蛋白质，调节LoxP位点的分子内（切除、反接）和分子间（整合）的特异性重组。Cre的作用与酵母中的ＦＬＰ重组酶作用想相似，但又有所不同。在体外状态下，无辅助因子、拓扑异构酶和ＤＮＡ不复制时也可发挥其生理作用。

　　Cre重组酶折叠成两个不同的区域，并通过一个较短的分隔区相连。Ｎ末端由20∽120个氨基酸组成的5个α螺旋，Ｃ、Ｄ、Ｅ形成反平行束；Ａ、Ｂ螺旋垂直于三个反平行束。Ａ、Ｅ区负责4聚体的形成；Ｂ、Ｄ区分与ＬoxP DAN大沟半个回纹结构相连接；Ｃ末端Ｎ螺旋远离其他螺旋，有助于Cre亚基间接触。Cre的Ｃ端结构与λ和HPI整合酶的催化区较为相似，但2个与LoxP结合的Cre分子间Ｃ末端构象出现较大的偏差，这种偏差说明只有一个亚基具有剪切活性。 

3　Cre重组酶所作用的序列 

　　Cre所作用的序列为中间有一个8bp非对称间隔区所分隔的回纹结构：LoxB、LoxR、Loxl和有两个13bp的反向重复序列的LoxP。 

　　一个Cre分子结合一个重复序列或者二聚体结合两个反向重复序列，重组发生在8bp的分隔区内。此8bp的间隔区又负责位点的定向。LoxP有两个13bp的反向重复序列，而LoxB有两个近10kp的反向重复序列。所有的Cre作用序列均具有一定的方向性。LoxP和LoxB的杂交可在两个方向上进行，因此可分别形成两种LoxR与LoxL。LoxP与LoxB的重组效率较低，但LoxB是Ｐ1噬菌体整合到宿主菌基因组内的重要切入点。LoxP和LoxL 的重组效率比LoxR与LoxB的重组效率高。Cre/LoxP系统的一个最为重要的特点是在两个LoxL位点间能发生重组，当两个LoxP反向时，使LoxP间的外源基因反向连接；当同向时，Cre重组酶剪切LoxP间的外源片段，并保留后边一个LoxP位点。 

4　作用方式 

　　重组酶先和ＤＮＡ结合，但结合力较弱，当遇到LoxP位点时则结合力增加20倍以上；当有两个LoxP时结合力更高。在对体外表达出Cre蛋白的研究表明，Cre无核酸酶和拓扑异构酶活性。 

　　其作用方式是将一端ＤＮＡ双链形成holliday结构的中间产物，然后与第二个双链交换，去掉中间产物发生重组。在Ｌox结构的两个回纹序列上各结合一个Cre亚基，由于两个亚基作用的非一致性，由此造成Lox位点的非对称剪切，产生holliday结构，完成基因的插入或删除之作用。 

　　Ｎ末端Ｅ区螺旋在裂解性Cre亚基中与ＤＮＡ骨架同向并和磷酸骨架形成静电结合。在非裂解性生长中，Ｃre亚基的Ｅ螺旋只处在邻近LoxP之间。Ｃ端主要与大小沟相接触，并与单个反向重复序列结合。 

　　Cre和ＤＮＡ结合后形成对称结构。Cre中2个亚基只有一个活性中心，保证了只有一个反向重复处ＤＮＡ发生断裂，也只有一个Ｃ末端与邻近的亚基结合，短的Ｌ－Ｎ螺旋也是 Cre酶的主要活性中心。 

　　一个活性区的氨基酸均来自于同一个亚基，这不同于ＦＬＰ重组酶共用一个活性区。Cre/LoxP的一个活性位点经过ＤＮＡ断裂后形成一个3＼磷酸酪氨酸，经过磷酸化酪氨酸的亲核攻击，使同一个短裂点的5＼端变成ＯＨ。同时由于构象变化和迁移使ＤＮＡ的方向发生改变。 

　　在大肠杆菌内λLoxP2同向时有近100％在单个周期内发生重组，而λLoxP2反向时有 反接，40%∽50%重组是由于一次反接一次正接，两者机会均等所致。重组效率和Cre含量无直接联系。 

　　重组既可在分子内发生，又可在分子间发生，但分子间效率比分子内效率低，并产生染色体易位。Cre重组酶不同于其他重组酶，对目的片段构象无太多要求，也即与质粒结构（超螺旋、有缺口或线形）无关。现已经有了Cre重组酶的商品化产品，其作用效果和体内的一样。Cre重组酶对目的片段发生作用之后，使目的片段产生两个分子，铰链在一起和游离式两种，但两者比率是等同的，这又不同于其他重组酶Ｔn3/re。 。 

5　Cre/LoxP系统在转基因中的应用 

　　λ噬菌体整合酶需要其他辅助因子进行重组反应，相反Cre重组酶不需要其他辅助因子，并且能完成体内或体外的各种ＤＮＡ的重组。凭借Ｃre/LoxP系统作用的简单性，使得其在体内和体外状态下的应用得到迅速发展，如进行合成抗体文库的工程操作、位点特异性的染色体易位、目的基因删除、嵌合基因组、特定基因人化动物模型建立等方面的研究。 

　　利用Cre/LoxP系统的转基因动物往往通过两种方法进行实现，一个是先制备可在不同组织特异性表达Cre基因的转基因动物，然后用其与转基因中含有LoxP序列的转基因动物进行杂交，这样在表达Cre基因的特定组织内含有LoxP的转基因发生重组，从而达到对外源基因的遗传控制；另一种方法是制备成转基因动物后，通过在目的组织内注入Cre后也可造成转入基因的重组，但该种方法所进行的转基因重组不能遗传。由于CRE/LoxP系统在转基因中的诸多优势，使其在转基因中得到了广泛应用，下面介绍几种应用的实例以见一斑。 

　　5．1 内、外源基因失活或删除 借助组织特异性表达Cre基因，可以在发育的特定时期删除早期致死而在后期无法研究的基因；也可以用于删除在发育时过度表达的基因。 

　　淋巴细胞抗原受体基因座位经常发生突变和基因重组以保证机体对外源抗原的免疫性。但为了保证基因组结构的稳定性，ＤＮＡ聚合酶β(Polyβ)基因的表达产物参与ＤＮＡ的修复作用，如果使Polyβ基因失活则早期胚胎出现死亡，观察不到效果，然而采用可控重组技术则可以将该问题迎刃而解。 

　　利用同源重组技术构建含有两个ＬoxP位点的Polyβ基因的转基因动物。研究发现插入的两个LoxP位点对Polyβ基因的表达和活性无任何不良影响。选择具有LoxP-Polyβ-LoxP和无Polyβ的杂合体，然后与含有Ｔ细胞特异性表达Cre基因的转基因动物杂交，所产生的后代仅在Ｔ细胞内产生缺失纯合体；其它组织和器官中无任何变化。

　　5．2 内外源基因的激活 转基因的主要目的是对转入基因进行准确、高效的操作。我们在结基因进行删除操作的目的是了解该基因的反向效应，但我们还需要了解转入基因开启后的特定效应，也即是在特定时间或条件下对该基因进行开启，了解基因的正向效应。进行本操作之前首先制备在特定内源基因启动子和起始密码子之间插入一个带有两个同向LoxP 位点的终止序列，将该基因失活的转基因动物。然后同特定组织内表达Cre基因的动物杂交，在该组织内将终止序列删除，使目的基因得以表达。 

　　5．3 基因插入 经过同源重组技术，在基因组上人为构建一个LoxB位点；然后用连有外源基因的Cre/LoxP系统将外源基因借助LoxB位点整合到基因组上。此种重组是双向的，尽管整合效率较低，但是定点整合的一个重要手段。

　　5．4 染色体易位 在不同染色体上分别构建一个LoxP位点、经Cre重组酶的作用可以使得两条染色体上的LoxP位点重组，产生不同染色体上片段的交换。这种交换过程中可以产生一种含有两个着丝粒的一条染色体，进而产生染色体易位。

　　5．5 基因的条件性激活或删除 与类固醇激素受体的激素结合区相结合的融合蛋白，所加入的外源蛋白活性是配体依赖性的（特别是雌激素受体激素结合区），既当有配体存在时外源蛋白有活性，无配体时则没有活性。现在已经研究的有癌蛋白、转录因子、丝/苏氨酸激酶等，当与配体结合时均呈现出高的活性。假如用雌激素受体构建含有Cre基因的融合蛋白，所表达的融合蛋白在有雌激素作用时，Cre蛋白才具有生物活性，进而达到条件重组之目的。 

　　通过同源重组制备在视黄醇基因两侧含有两个同向LoxP位点的转基因动物；用Cre基因替换雌激素受体的ＤＮＡ结合区，制备成另一个可组织特异性表达Cre雌激素配体结合区融合蛋白的转基因动物，两者杂交后。通过使用雌激素，Cre通过两个LoxP位点间重组，使得视黄醇Ｘ受体基因被删除，这样经过使用雌激素便可达到基因重组之目的。为了避免体内雌激素的干扰，可将雌激素受体基因的配体结合区做一定程度的改变，使其只能和某些雌激素衍生物相结合，使条件重组的特异性更强。

　　基于Cre/LoxP系统在转基因动物中进行遗传操作所具有的优良特性，许多科技工作对此已进行了大量、卓有成效的研究和开发工作，特别是在小鼠的转基因研究中应用得最为广泛和深入。Cre/LoxP系统由于其短小精悍、Cre酶作用的非常专一性，因此在转基因载体制备过程中值得加入此种序列，而不影响基因的正常表达与调控，Cre/LoxP的应用可为转基因的遗传调控开辟出一条崭新的途径。 

胡礼泉

湖北武汉人，1933年生，1950年中原大学专科毕业，1961年同济医学院本科毕业。武汉大学中南医院外科学教授、泌尿外科主任医师、博士生导师，中南医院泌尿外科创始人，中华医学会男科学分会组建人之一，历任武汉大学中南医院外科及外科学教研室主任、泌尿外科主任、副院长、医学二系副主任，武汉大学医学院泌尿外科男科学研究中心主任，中华医学会男科学分会第一、二届副主任委员、第三届顾问，湖北省和武汉市泌尿外科学会副主任和主任委员，湖北省和武汉市男科学会主任委员，国际泌尿外科学会和世界中老年男子健康研究会资深会员，中华系列等10个全国性杂志编委、常务编委、副主编，Chin Med J、Asian J Androl特约审稿人，国家自然科学基金、中华医学奖和中华青年医学奖评审专家。

历年主持承担国家和省自然科学基金课题多项， 在低温肾保护作用、前列腺手术改进、胃代膀胱、阴茎勃起功能障碍的研究方面有重大突破，由他设计和作为第一作者主持完成的“原位控制性肾低温研究”、“部份胃体-窦部代膀胱”、“改良前列腺切除术”、 “阳萎基础与临床系列研究”等科研成果,均达到国际水平或国际先进水平，主编《男科学》，《临床男科学》等专著6部。参编《吴阶平泌尿外科学》、《黄家驷外科学》等专著多部。

发表论著160余篇，获省部级科技进步二等奖三项, 三等奖四项，鉴于他为我国泌尿外科和男科学的发展做出了突出贡献，1989年获湖北省首批有突出贡献专家称号，1991年享受首批政府特殊津贴，两次被卫生部授予全国卫生文明先进工作者称号，2004年中华医学会男科学分会授予他“特等成就奖” 。 


主要学术论著 

· Apoptosis in rat erectile tissue induced by castration
· Fibrosis of corpus cavernosum in animals following cavernous nerve ablation
· MTS1基因在人BPH中突变缺失的初步研究
· 武汉市2811例男性下尿路症状问卷调查
· 胃液对膀胱癌细胞系生长抑制 细胞凋亡及bcl-2/bax表达的影响
· 大鼠阴茎海绵体nNOS 神经纤维损伤后再生可能性的研究
· 勃起功能障碍研究的历史、进展和展望
· 雄激素对大鼠阴茎组织血管内皮生长因子及其受体表达的影响