新技术提升人类基因组修复效率

　　利用定制好的DNA切割酶，研究人员可以大大提高人类细胞同源重组的概率，这对基因治疗具有巨大的应用潜力。

        通过定向同源重组，可以改变活细胞的基因组序列，进而对整个动物体进行基因重组，这在生物学上带来了一场革命。不幸的是，尽管传统的定向策略在小鼠胚胎干细胞中非常有效，但被用于人类时则不尽人意，其同源重组率相当低。其他的替代方法(如利用病毒载体)也有一定效果，但存在转基因位点不恰当，或内源基因序列被破坏的危险，这会带来严重的后果。

        在双链DNA断裂处同源重组发生的机率非常高；理论上来说，如果能准确地选择基因组断裂区，则基因定向化可能更加有效。其中人们熟知且最具特征的DNA结合蛋白基元是锌指状物，它通过α-螺旋区域识别并结合特定的3-4个核苷酸序列，Johns Hopkins和Srinivasan Chandrasegaran 的研究表明，交换具有不同特性的锌指状物区域，可以改变核酸酶的定向性。Utah大学的Dana Carroll 和德克萨斯大学西南医学中心的Matthew Porteus，对该项工作进行了更进一步研究，即利用嵌合的锌指状物核酸酶(ZFNs)刺激青蛙、果蝇和人类细胞进行同源重组(Bibikova等人，2003；Porteus和Baltimore，2003)。

        通过与Porteus进行合作，Michael Holmes和他在Sangamo 生物科学公司(位于美国加利福尼亚洲的Richmond)的同事着手改进这一技术，同时也是为了寻求新的基因治疗方法。“事实上，我们可以将锌指状物定位到基因组的任何序列中，”Holmes说，“并且，我们可以用具有3个、4个或6个锌指状物的区域来完成这项工作，这可以使我们了解可识别9个、12个或18个碱基对的区域的基本特征。”为了进行切割，两个锌指状物核酸酶必须同时起作用：两个酶分别与目标两侧的位点结合，再进行切割，然后染色体和“供体”DNA分子之间进行同源重组，从而改变染色体的基因序列。

        利用人类红白血病K562细胞进行试验，研究小组发现了IL2RG基因，该基因导致X连接严重结合免疫缺陷(SCID)。利用最适合的锌指状物核酸酶来调节沉默点突变体的导入，研究人员将同源重组率提高到21%。经过一段时间后，同源重组率仍然稳定，甚至在一个月之后，被改变基因的细胞相对比例仍然保持不变。第二轮的试验结果表明，在处理的细胞中，内源等位基因位点被修饰的细胞占6.6%。适当降低杂合和纯合突变体中可检测的mRNA和蛋白质水平，这一试验技术也可被用于将结构改变的杂合和纯合突变体导入到相同基因中。该研究小组声称，他们研制的锌指状物核酸酶既可调节点突变体的导入，也可调节大序列片断的导入。

        在阐明高效定向双等位基因修饰的可行性之后，Holmes指出，他的研究小组现正在着力改善这一试验系统的实际应用性。“我想我们的短期目标是构建更好的载体系统，以使我们能将我们的核酸酶和供体分子导入到一些重要的分子中，比如T细胞和干细胞，并使这项技术既可以用于动物研究，必要时也可用于临床试验。”这项技术可能对基因治疗的应用具有重要作用，用于动物实验的初步计划已在进行中。“我们正在计划利用动物实验进行X连接SCID项目，我们认为，另外一个项目可能在不久的将来对临床试验具有非常大的潜力，那就是以CCR5为目标，对CCR5 进行修饰，来增加细胞抵抗HIV感染的抗性。” 

        注：才良翻译自2005年第六期的《自然-方法学》，版权为英国NPG出版集团所有。