植物的钙调素亚型

　　钙调素(calmodulin，CaM)是一种高度保守的多功能Ca2+结合蛋白，在介导Ca2+信号转导途径中有重要作用。目前已经发现CaM存在于所有已被研究过的真核生物之中，来自于不同物种CaM的氨基酸组成和序列有高度相似性，参与许多钙依赖性的生理反应过程。CaM晶体结构研究的结果表明，CaM分子的N端和C端为两个球形结构域，中间通过一段α螺旋相连。每个球形区含有一对EF-手型Ca2+结合结构域，1个CaM分子可以结合4个Ca2+。Ca2+与CaM结合后形成的Ca2+- CaM复合体可引起CaM的构象变化，暴露出球形区带负电荷的疏水性表面，并在CaM与靶蛋白相互作用中起作用。

　　脊椎动物中有多种CaM基因，但它们编码的 CaM蛋白具有完全一致的氨基酸序列，而在植物中发现的多种CaM基因，它们编码相同或相似的蛋白，这些蛋白都具有EF-手型Ca2+结合结构域，都能够与Ca2+结合，因此将这些CaM及其相似蛋白称为CaM亚型(isoform)。这些CaM亚型在植物生长发育过程中以及对不同刺激信号的反应性中的基因表达状况不同。CaM亚型的氨基酸组成变化可能使其与不同的靶蛋白相互作用，从而完成不同的生物学功能。植物中多种CaM亚型的存在进一步增强了Ca2+信号介导的信号网络的多样性和复杂性。

1 植物CaM亚型的存在

　　到目前为止，在不同植物中已分别克隆到多种CaM基因，植物体中广泛存在CaM多基因家族已是不容置疑的事实。拟南芥中CaM亚型是最早得到克隆的，目前至少已经克隆到9个CaM基因；马铃薯、大豆、小麦中分别分离鉴定了8、5、10个CaM基因。另外，在玉米、豌豆等中都克隆到了不同的CaM多基因家族。其中，以马铃薯和大豆的植物CaM多基因研究较为深入。

　　Takezawa等分析马铃薯中8个CaM基因(PCM1～8)的结构表明，PCM1、5、7和8与通常的CaM基因一样，均含有2个外显子及1个内含子(1.5～2.7 kb)；而PCM2、3、4和6则没有第一个外显子。比较8种基因的编码区表明，这些基因序列高度保守，而在5'和3'非编码区则存在很大的差异。从比较根据基因推断出的蛋白序列来看，PCM5、6、7、8的序列完全相同，且和拟南芥的ACaM-2以及大麦CAM-1编码的蛋白十分相似；PCM-1则含有特殊的氨基酸序列，特别是在第四个Ca2+结合区的氨基酸序列与其它几种不同，但与鸡CaM的第四个Ca2+结合区完全相同。Lee等用水稻的CaM基因为探针，从四天龄的大豆黄化苗下胚轴组织制备的cDNA文库中克隆到5个CaM的cDNA(SCaM1～5)，比较推断的氨基酸序列表明(图1)，SCaM-1、SCaM-3编码相同的氨基酸序列；SCaM-1、SCaM-2编码蛋白在N端相差2个氨基酸；SCaM-4、SCaM-1编码氨基酸相差32个；SCaM-5、SCaM-1编码氨基酸相差33个；SCaM-5、SCaM-4编码氨基酸相差15个。可见SCaM-4和SCaM-5编码的蛋白和 SCaM-1编码蛋白相比具有很大的差异。

2 植物CaM亚型基因表达的特异性

　　在同一植物中往往存在多种CaM亚型，各 CaM亚型基因在植物各种组织中的表达存在特异性，并且，在植物生长发育及各种环境刺激条件下，各CaM亚型基因的表达也存在差异。

　　Takezawa等研究马铃薯CaM亚型时，采用 RNA印迹(Northern blot)技术分析的结果表明，发育过程中不同器官中的CaM亚型基因的表达有差异。根尖中PCM1、5、8表达最高，其次是芽，再次是根，叶中表达最低。在块茎的发育过程中，PCM1 mRNA的量明显下降。PCM6 mRNA在各种组织中均稳定表达，只是在叶中表达最低。PCM4 mRNA在各种组织中的含量都非常低。在上述实验组织中均未检测到PCM2、3 mRNA的存在，推测这两个基因可能在某些特殊的组织或器官中(如花中或在花粉萌发时)表达。8种CaM基因对外界信号刺激反应的表达模式也不相同。实验表明PCM1与发育调控和触摸刺激反应有关，而与PCM1在马铃薯发育中有相同表达模式的PCM5和PCM8则对触摸刺激没有反应，这暗示在马铃薯中存在两种相互独立的CaM基因表达调控机制；在马铃薯发育过程中PCM5和PCM8的启动子和PCM1启动子分别由同一种机制调控，而在触摸反应时由于PCM5和PCM8启动子缺少某一顺式调控元件，所以触摸刺激不能诱导它们的表达。从推断的氨基酸序列来看，PCM1与其它CaM亚型相比含有特殊的氨基酸序列，而且其基因表达调控也和其它CaM亚型基因有所不同，这表明它可能在植物生长发育和触摸刺激信号转导中起作用。观察转CaM基因马铃薯植株的表型时发现，只有转PCM1基因植株表型明显改变，而转其它CaM亚型基因(PCM5、PCM6和 PCM8)的植株表型无明显变化。在转PCM1基因植株中，PCM1 mRNA量呈中等程度增加的植株与野生型植株相比，植株顶端优势增强，块茎伸长，植株增高：高水平表达PCM1 mRNA的植株不能形成地下块茎。表明PCM1在植物生长发育中有作用。Lee等通过对大豆不同组织 RNA印迹分析表明，SCaM-1、SCaM-2表现出相同的表达水平，二者在所检测的组织和器官中均有表达；SCaM-3与SCaM-1、SCaM-2具有相似的表达模式，但是在胚轴尖端表达量较低； SCaM-4在下胚轴尖端和伸长区有表达，但表达的量比SCaM-1低5倍，在成熟组织中二者表达相同，表达量均非常低，而在SCaM-1丰富表达的根中SCaM-4几乎不表达。这表明SCaM-1、 SCaM-2和SCaM-3基因的转录调控可能相同， SCaM-4则属于完全不同的转录调控。

　　研究不同亚型CaM基因调控的结果表明，不同亚型植物CaM基因的表达有组织、器官和发育不同时期的特异性以及对外界信号刺激反应的特异性等。例如，Ito等从拟南芥基因文库中分离到5个CaM基因(AtCAL1、2、3、5、6)和1个 CaM相关蛋白基因(AtCAL4)，它们对机械刺激(触摸、风、雨)的反应不相同，在机械刺激条件下，只有AtCAL4、5的表达受诱导，而且这两种基因 的表达存在组织特异性。另外，在马铃薯和花 椰菜等植物中也发现了不同CaM亚型基因的组 织特异性表达特性。Yang等从小麦中鉴定了 10个CaM基因，它们编码4类CaM亚型(CaM SF1～4)；在小麦发育过程中，不同亚型CaM基因 的表达具有器官、组织和细胞特异性。最近， Duval等从萌发豌豆种子中鉴定了3个CaM亚型 (PsCaM1～3)，在种子萌发过程中3种基因具有不 同的表达模式。由此可见，在植物生长发育及不 同刺激条件下，CaM基因表达的差异表明不同 CaM亚型的启动子中存在不同的顺式调控元件， 并且不同的CaM亚型介导各自特异的信号转导途 径。

3 植物CaM亚型激活靶酶的特征

　　分析不同CaM亚型对CaM依赖性靶酶激活能 力的结果表明，不同的CaM亚型在体内可以竞争 结合相同靶蛋白，由于不同CaM亚型对Ca2+的亲 合能力不同，所以它们在调节靶酶及由此而参与 的Ca2+信号转导途径也存在差异。

　　Lee等的研究结果表明，SCaM-1和SCaM- 4对CaM靶酶——NAD激酶和磷酸二酯酶(cyclic nucleotide phosphodiesterase，PDE)的激活特性确实 存在很大的差异：SCaM-1和SCaM-4均以依赖于 Ca2+的方式激活PDE；SCaM-1以依赖于Ca2+的方 式激活NAD激酶，而SCaM-4在达到SCaM-1最 高激活浓度的500倍时，仍对NAD激酶没有激活 作用。这表明SCaM-1和SCaM-4可能有各自不同 的靶酶。Lee等进一步以SCaM-l和SCaM-4对 NAD激酶的不同激活作用为基础，对其分子结 构，特别是对CaM和NAD激酶的作用位点作了 十分细致的研究工作。通过SCaM-1和SCaM-4相 互替换功能区(Ca2+结合区)而产生一系列嵌合体的 实验证明，SCaM-1的第一个功能区对NAD激酶 的活性有决定性作用，SCaM-1和SCaM-4在第一 个功能区中的氨基酸差异使得它们对相同的靶酶 (NAD激酶)具有不同的激活作用。Liao等的研究 也表明拟南芥CaM亚型(CaM-2、4和6)对NAD激 酶的激活效率不尽相同。

　　Cho等的进一步实验发现，大豆CaM各亚 型不但对不同的靶酶激活能力不同，而且对相同的靶酶也有彼此相反的调节作用。SCaM-1和 SCaM-4能选择性地拮抗抑制不同的靶酶。SCaM-4在180 nmol/L时能激活哺乳动物的一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)最大活性的50％，而SCaM-1大约在120 nmol/L时对NOS酶活性起拮抗作用。相反，SCaM-1在12 nmol/L时激活钙调磷酸酶(calcineurin，CaN)最大活性的50％，而 SCaM-4在70 nmol/L时对CaN活性起拮抗作用。 Lee等以标记的大豆CaM各亚型为探针，采用凝胶覆盖方法发现，虽然SCaM-1和SCaM-4都与大豆不同组织的提取物中的大部分CaM结合蛋白(CaMBP)结合，但它们与这些CaMBP的结合能力有差异；采用5种已知的植物CaMBP进行结合实验的结果表明，SCaM-1和SCaM-4都与它们结合，但在竞争结合实验中，当两种CaM亚型同时存在时，它们之间竞争性地与CaMBP结合。

　　Lee等研究CaM亚型激活靶酶的特性时观察到， SCaM-1和牛脑CaM都能够有效地激活肌球蛋白轻链激酶(myosin light-chain kinase，MLCK)，而 SCaM-4则不能激活此酶；SCaM-1和SCaM-4都能激活CaM依赖性蛋白激酶(CaM-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)以及动、植物的Ca2+-ATPase，但SCaM-4的激活效率比SCaM-1低；SCaM-1对植物谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)，能够达到最大激活，而很高浓度的SCaM-4也仅能部分激活该酶；另外，各种SCaM亚型对靶酶的激活需要不同的Ca2+浓度。半激活CaMKⅡ时， SCaM－4需要的Ca2+浓度比SCaM-1高4倍；半激活PDE时，SCaM-4需要的Ca2+浓度比SCaM-1高1.5倍。因此，他们将CaM依赖性靶酶总结为三类：一类是可被SCaM-1和SCaM-4激活的靶酶；另一类是仅被SCaM-1激活而SCaM-4充当竞争性拮抗剂的靶酶；第三类是仅被SCaM-4激活而 SCaM-1充当竞争性拮抗剂的靶酶。最近的研究表明，植物CaMBP表现为对不同CaM亚型亲和力的差异。KCBP(kinesin-like CaM-binding protein)是一种具有依赖Ca2+的CaM结合特性的驱动蛋白样 CaMBP。拟南芥CaM亚型(CaM-2、CaM-4和CaM-6)都以依赖Ca2+的方式与KCBP结合，但与CaM-4和CaM-6相比，CaM-2与KCBP的亲和力高2倍，这表明不同CaM亚型与靶蛋白的结合能力各不相同。AtCNGC1-6(Arabidopsis thaliana cyclic nucleotide-gated channels)是Kohler等从拟南芥中鉴定的一类具有依赖Ca2+的CaM结合特性的环核苷门控的离子通道。Kohler等的研究表明不同的CaM亚型与AtCNGC1和AtCNGC2的CaM结合结构域的结合能力不同。AtCaM2和AtCaM4能与AtCNGC1和AtCNGC2结合，并且两种CaM亚型与两种AtCNGC的结合力存在差别，而AtCaM8和AtCaM9不能与AtCNGC1和AtCNGC2结合，推测AtCNGC家族的各成员功能不同。

　　CaM各亚型在植物中的表达不同，其激活或抑制专一性的靶酶能力以及对CaMBP结合竞争力也不同，这就决定了它们在细胞内Ca2+CaM信号转导过程中能形成不同的分叉转导通路。

4 植物CaM亚型的生物学功能

　　植物中不同的CaM亚型表现出不同的生物学功能。Heo等发现，当大豆受到大豆叶斑病杆菌(Pseudomonas syringae pv．glycinea)或病原激发子的侵染时，侵染后30 min即可诱导SCaM-4和 SCaM-5基因的表达，但不诱导其它CaM亚型基因的表达。他们进一步研究转SCaM-4和SCaM-5基因烟草时发现转基因植株对多种病原菌具有很强的抗性，能自发地形成病斑和诱导一些系统获得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)相关基因的表达；他们同时发现SCaM-4和SCaM-5以不依赖水杨酸(salicylic acid，SA)的信号转导通路诱导 SAR相关基因的表达。Yamakawa等从烟草中分离到13个CaM基因(NtCaM1～13)，烟草枯叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)侵染叶片后可引起细胞死亡并伴随NtCaM1、2、13转录本及NtCaM13蛋白的积累，同时诱导PR-1和PR-3等防御基因的表达；伤害刺激后30 min可诱导NtCaM1、2、3转录本积累，NtCaM1蛋白瞬间积累；在健康叶片中，NtCaM13蛋白维持在低水平，伤害后立即降低。这表明病原和伤害刺激下转录和转录后水平上对各种CaM亚型的调控不同。最近， Townley和Knight用AtCaM3超表达转基因拟南芥研究的结果表明，AtCaM3超表达抑制冷诱导基因COR的表达。

　　近来的实验表明，CaM各亚型能够采用翻译后的不同修饰影响其亚细胞定位，从而发挥不同生物学功能。Rodriguez-Concepcion等在矮牵牛中发现了一种新的命名为CaM53的CaM亚型，它的N端有150个氨基酸的CaM区域，C端有由34个氨基酸组成的富含赖氨酸和精氨酸的区域，其最后4个氨基酸为CTIL的CaaX结构域，此结构域是异戊二烯化所必需的。亚细胞定位的研究发现，异戊二烯化的CaM53定位在质膜上，而未异戊二烯化的CaM53则定位在细胞核中。转基因的实验表明，CaM53的异戊二烯化可以引起不同的表型，并且当异戊二烯合成受阻或者蔗糖缺乏时CaM53的亚细胞定位发生变化，更多的 CaM53定位到细胞核中，可见植物能够采用 CAM53的修饰来调控CaM53的分布，CaM53不同的亚细胞定位结合不同的靶酶，从而调节Ca2+ CaM信号转导过程中的时空性。Aiwu等发现水稻中也存在与矮牵牛的CaM53类似的CaM(OsCaM61)。这一切都暗示CaM可能不像以前的传统概念那样以一种形式调控植物体内的众多生理过程，而是植物体中存在多种亚型的CaM，它们各有其特异的靶酶，分别调控特异的生理反应，即不同亚型的植物CaM在不同组织、不同信号、植物体发育的不同阶段所起的作用有差异，即植物体中存在CaM亚型特异性的生理过程。

5 细胞外CaM的存在及亚型特异性分析

　　近年来，我们实验室一系列的研究结果表明：细胞外也存在CaM并具有普遍性，而且具有多种生物学功能，如能促进细胞增殖、促进原生质体细胞壁的再生以及第一次分裂、启动和促进花粉萌发花粉管伸长、诱导不依赖光的rbcS基因表达等。我们实验室的研究还表明：Al3+对细胞毒害的原初位点之一可能是在细胞外，而且很可能是通过抑制细胞外CaM的活性起作用的；La3+元素对植物细胞生长的促进作用机制也与胞外CaM有关；异三聚体G蛋白、 Ca2+、磷脂酶C(phospholipase C，PLC)均参与细胞外CaM的信号转导机制。据此，我们提出的细胞外CaM信号转导机制模型认为：Ca2+活化的细胞外CaM可能作为第一信使与质膜表面 CaM结合蛋白(或受体)结合而激活异三聚体G蛋白，活化的G蛋白一方面可能活化质膜表面的 Ca2+通道，使细胞质内自由Ca2+浓度升高，另一方面又激活质膜上的PLC，产生三磷酸肌醇(IP3)并动员胞内钙库中Ca2+的释放，Ca2+则可能通过激活蛋白质磷酸化反应调节生理功能和基因表达。根据我们对细胞外CaM的存在、生理功能及跨膜信号转导机制的研究结果，我们提出了细胞外 CaM可能是作为一种多功能肽类信使在植物生长发育过程中发挥作用的观点。

　　最近，我们又用绿色荧光蛋白(green fluores- cent protein，GFP)标记在转CaM-GFP融合基因植物细胞中研究了大豆SCaM-1与SCaM-4的亚细胞定位，以及随后对大豆中存在的5种CaM亚型进行亚细胞定位的研究中发现，SCaM-1、SCaM-2、 SCaM-3不仅存在于细胞内，而且还存在于细胞外；而SCaM-4、SCaM-5仅存在于细胞内。据此，我们认为细胞外CaM的存在可能具有亚型的特异性(待发表资料)，这为进一步采用分子生物学手段研究细胞外CaM的生物学功能奠定了基础。

6 结束语

　　综上所述，可以看到，由于CaM亚型表达的差异性、靶蛋白的特异性、激活或抑制专一性的靶酶能力的不同以及对Ca2+敏感性的差异，使得CaM亚型能在调节细胞Ca2+-CaM信号转导途径中起关键性作用，植物中存在多种CaM亚型，各有各自的特异作用机制及生理功能。Snedden和 Fromm总结CaM亚型特异性工作模型时，提出6种CaM和CaM相似蛋白调节细胞反应的可能机制：(1)1种CaM亚型仅调节1种相应的靶蛋白，而不调节其它靶蛋白；(2)不同的CaM亚型对不同的 Ca2+信号产生反应；(3)1种CaM亚型对2种酶(例如：蛋白激酶和磷酸酶)的激活和抑制作用相反；(4)在体内条件下，各种CaM亚型竞争性调节靶蛋白；(5)CAM亚型通过其在细胞内的移动调节不同细胞区域的靶蛋白；(6)刺激信号可诱导特异CaM亚型的表达。

　　Ca2+-CaM信号转导途径在植物生长发育以及对环境的适应中起关键作用。相信，随着植物中存在CaM亚型研究的日益深入，人们将会进一步阐明不同CaM亚型的特异生物学功能、CaM亚型的亚细胞定位和生理功能与靶酶结合的相关性。另外，CaM与靶酶作用机制的研究也将有助于了解CaM在植物生长发育过程中的作用。 

        注：

        （1）参考文献：略；需者可与本站Email联系，或到中国水稻研究所图书馆查阅；

        （2）文章来源：植物生理学通讯，2005年41卷第1期；

        （3）作者单位：河北师范大学生命科学学院。