RNA干扰文库及其在功能基因组学研究中的应用

　　         人类基因组大规模测序已经基本完成。但破解基因组的序列只是一个起点，目前多数基因的功能还不清楚，因此基因功能的研究是今后 的发展趋势。传统研究基因功能的最有效技术之一是细胞和小鼠的基因敲除技术。但该技术存在技术复杂、周期长、费用昂贵等缺点，极大地 限制了它的应用。应用物理和化学突变技术可以诱导基因的随机突变，导致细胞或动物表型的缺陷，直接进行基因功能的筛选。但由于该方法 通常需要两个等位基因同时突变才会出现明显的表型，成功的机会比较低。而RNA干扰(RNA interference，RNAi)文库有希望成为一种简单、高 效、大规模、高通量的功能基因组学研究的工具。

1 RNAi及RNAi文库

　　RNAi是近年来的重大发现，是动物和植物界普遍存在的一种防御反应。RNAi被细胞内出现的双链RNA(dsRNA)所激活，可以高度特异地抑 制同源基因的表达。根据目前的研究，RNAi的可能机制如下：长片段dsRNA在细胞内被Ⅲ型RNA酶Dicer切成长度大约为19～23 nt的小片段干扰 RNA(small interfering RNA，siRNA)，由siRNA参与构成复合物RISC(RNA-induced silence complex)。 siRNA通过与同源mRNA的特异配对，引 导RISC特异地降解同源mRNA，导致基因表达的抑制。因此小片段的siRNA也可以诱导高效的基因沉默。

　　在线虫，注射或喂食dsRNA能引起特异基因在动物各器官的沉默，而且该抑制作用可以持续到第一代的子代动物。但是在哺乳动物细胞 ，通过长片段dsRNA直接转染会引起细胞的毒性反应，基因沉默效果差。近年来，陆续有用体外合成的 siRNA，或用质粒、病毒等载体在细胞内 表达 siRNA达到在细胞和小鼠抑制特定基因表达的报道。

　　RNAi文库(RNAi library)是人工构建的能通过诱导RNAi抑制众多不同基因表达的混合文库，可以用于建立功能缺陷(loss offunction) 的生物或细胞库，进行表型的筛选。该技术在线虫的应用最为成功。在线虫等模式生物的研究中，应用RNAi文库建立随机基因抑制的线虫，再 进行表型的筛选，已在其胚胎发育等领域取得了重要的发现。该文库用含方向相对的两个T7启动子的载体，可从一个随机克隆的cDNA模板分别 转录出长片段的正义和反义RNA，形成dsRNA，在体内被Dicer切割成小片段的siRNA，特异地抑制靶基因的表达。由于细胞外dsRNA不能在哺乳动 物细胞有效地诱导RNAi，另外，长链dsRNA(>30nt)可导致哺乳动物细胞的毒性反应，出现非特异的细胞生长停滞和凋亡，上述转录长片段dsRNA 建立RNAi文库的方法不能应用于哺乳动物及其细胞。



　　线虫等模式生物与人的差距较大，从模式生物获得的研究结果虽然有比较重要的意义，但不能取代在人和其他高等动物的直接研究。因 此建立可以用于人的细胞以及其他哺乳动物细胞的RNAi文库有非常重要的意义。RNAi文库将为研究基因功能、发现新的药物靶基因、发现疾病 相关基因、探索肿瘤治疗新途径等提供重要的方法。到目前为止，已经报道的在哺乳动物细胞建立RNAi文库的方案有两类。我们将对这两类建 库方案及其在功能基因组学研究中的应用作一介绍。



2 哺乳动物细胞已知基因RNAi文库



　　哺乳动物细胞已知基因RNAi文库构建的方法如下：首先选定靶基因，根据靶基因的DNA序列和siRNA设计原则，合成siRNA，或合成寡核 苷酸序列并克隆到表达载体，或用PCR的方法扩增为siRNA表达盒。众多针对不同基因的siRNA或 siRNA表达载体或表达盒即构成有限的RNAi文库 。应用该文库转染哺乳动物细胞可以特异地抑制不同基因的表达，通过表型的筛选来发现功能基因，如信号转导通路新分子的筛选、与肿瘤细 胞存活或转移相关基因的筛选等。



　　Aza-Blanc等应用Dharmacon公司生产的针对510个基因(包括了大多数激酶基因)的siRNA文库，通过转染HeLa细胞筛选了对TRAIL诱导细 胞凋亡有调控作用的基因。TRAIL是TNF家族的一员，具有抗肿瘤的功能。实验证明，TRAIL蛋白能同DR4和DR5受体结合，诱导多种肿瘤细胞的凋 亡，而对正常细胞没有影响。Aza-Blanc等的筛选既发现了一些能增强TRAIL诱导细胞凋亡的基因，也发现了一些具有抑制作用的基因。这些基因包括以前已知对TRAIL功能有调控作用的基因如 GSK30α和SRP72，也包括一些未知的调控 基因如 DOBI、MIRSA等，对了解TRAIL的作用机制和抗肿瘤药物的开发有重要的意义。



　　Berns等构建了针对7914个基因的人RNAi文库。他们应用了shRNA(short hairpin RNA)反转录病毒载体，每一个基因构建了3个不同的 shRNA载体，共有23742个不同的载体。用该 RNAi文库进行基因功能的筛选，发现了1个已知、5个未知的在p53依赖的增殖阻滞中起调控作用的 基因。进一步的研究证明，抑制这些基因的表达导致细胞对p53和p19ARF依赖的增殖阻滞以及对 DNA破坏诱导的G1细胞周期阻滞均 不敏感。 Paddison等应用shRNA病毒载体，构建了针对9610个人基因和5563个小鼠基因的shRNA表达文库。在26S蛋白酶系统的功能基因筛选中 ，证实该RNAi文库的实用性和可靠性。



　　Zheng等构建了一个双启动子载体pDual。该载体包含两个方向相对的聚合酶Ⅲ启动子，分别为小鼠的U6启动子和人的H1启动子，中间插 入能转录siRNA的DNA序列(图1)。该载体的优点是，正义和反义RNA从同一DNA序列转录，减少了合成DNA序列的长度，降低了费用和工作量。他 们巧妙地设计了能用PCR扩增的含双启动子的 siRNA表达盒，并证实可以在哺乳动物细胞有效地抑制基因的表达。应用这一技术，他们构建了针 对8000个基因的siRNA表达盒，在大规模的功能基因筛选中发现了一些已知和未知的在NF-KB信号转导通路中起重要作用的基因。



　　Silva等将siRNA和siRNA表达载体与转染试剂混合后以微阵列的形式点在细胞培养板上，可以转染在板上生长并与之接触的活细胞。该 技术为应用RNAi文库进行细胞的基因功能筛选提供了一个简单有效的方法。



　　上述研究均证明了有限的已知基因RNAi文库在哺乳动物细胞基因功能研究中的可行性，为哺乳动物及其细胞大规模功能基因组学的研究 提供了一个重要的技术。



　　已知基因RNAi文库存在以下缺陷：a．不是随机RNAi文库，必须知道靶基因的序列，细胞基因的覆盖面窄；b．针对每一个基因必须合成 2条以上寡核苷酸，才能确保从中选出干扰效果较好的；C．需要合成众多的不同siRNA，或构建众多的不同载体；d．所需费用高，筛选的工作 量巨大。



3 晡乳动物细胞随机RNAi文库



　　随机RNAi文库(random RNAi library)是人工构建的可能针对任何基因的RNAi文库。目前已报道的方法有两种，一是通过化学合成随机 DNA序列的方法，二是通过cDNA酶切并克隆到载体的方法。随机RNAi文库不需要知道靶基因的序列，因此理论上讲可以构成抑制任何基因表达的 干扰文库，克服已知基因RNAi文库细胞基因覆盖面窄的缺陷。该文库同常用的基因表达文库一样，为不同 siRNA载体的混合物，因此易于保存 ，显著地减少了筛选的工作量。



　　化学合成随机DNA序列构成随机RNAi文库的方法是应用以下原理。在化学合成寡核苷酸时，如果碱基选为N，则DNA合成仪在合成DNA片段 时将随机选择A、T、G、C中的任何一种。19～21 nt的寡核苷酸如果部分或全部选为N时，则形成了众多不同随机序列寡核苷酸的混合物。在进 行互补链合成并克隆到双启动子RNAi载体(见图1的载体)后，就形成了随机RNAi文库。



　　限制性内切酶Mme I的特点是在DNA识别序列(TCCGAC)下游20～21 bp处切开DNA片段。 Luo等巧妙地应用Mme I的独特特性，设计了将长 cDNA片段酶切为20～2l nt小DNA片段，克隆于siRNA表达载体构成随机RNAi文库的方案，称为SPEED。首先将随机cDNA片段与含Mme I酶切位点发 夹结构的DNA接头(linker)连接，再用 Mme I消化，获得20～21 bp与接头连接的cDNA小片段。将形成的双链DNA打开成单链，合成互补链，形成 方向相对的两个小片段cDNA的拷贝，中间为不配对的形成发夹结构的DNA序列。再克隆到反转录病毒载体中，构成随机RNAi文库。利用小鼠胚胎 cDNA文库，他们建立了含3×106克隆、可以抑制众多不同基因的随机RNAi文库，证明该方法的可行性。



　　Shirane等应用同Luo等基本相同的思路独立地设计了构建随机RNAi文库的方法，称为 EPRIL。应用鼠源FL5.12细胞的cDNA文库，他们建 立了随机RNAi文库。对240个不同克隆的随机测序发现，215个克隆含有正确的能表达siRNA的 DNA片段。BLAST分析显示，165个克隆的插入片段 与己知基因或EST的顺序相吻合，绝大多数分属不同的基因。这一结果说明，EPRIL可以用于复杂基因的随机RNAi文库的构建。



　　Sen等独立地设计了相似的建库方案，称为 REGS(restriction enzyme-generated siRNA)。为了测试该技术的效果，他们检测了对转基 因和内源基因的作用。实验证明，用该技术制备的RNAi文库可以有效地抑制GFP、Oct-3／4和MyoD的表达。他们应用该方案从混合cDNA构建了含 4×105克隆的随机RNAi文库。



　　虽然RNAi文库的构建和应用还存在一些问题需要克服，但该技术已经在大规模基因功能筛选和研究中显示出广阔的应用前景。它的成功 应用将有希望极大地促进基因功能方面的研究。　



        注：

        （1）参考文献略，需全文者可与本站EMail联系，也可到中国水稻研究所图书馆查阅；

        （2）文章来源：生物化学与生物物理进展，2005年32卷第3期；

        （3）作者单位：第三军医大学微生物学教研室。