非病毒类载体的分子生物药剂学研究

　　载体问题一直是基因治疗研究领域的核心技术之一。非病毒类载体因其安全、有效、无免疫原性等优点，已成为病毒类载体最有希望的替代者。从药剂学角度来看，非病毒类载体属于毫微粒给药系统（NDDS）范畴，包括脂质体、纳米粒、微乳、聚合物胶团等。根据基因药物的理化性质，通常将NDDS设计成表面带有正电荷的微粒给药体系，通过静电的作用与带负电的核酸形成复合物，复合物经内吞等方式进入细胞，然后释放出基因药物，转运至细胞核并在核内得以表达。这种极简单的静电吸附原理，已经贯穿于整个非病毒类载体20多年的研究中。但是，仍然存在着许多尚未解决的问题，尤其是其转染效率远低于病毒类载体。随着分子生物学、细胞学、免疫学、高分子材料科学等边缘学科的发展，药剂学中产生了一门新兴的研究领域———分子生物药剂学，即从分子水平和细胞学水平研究剂型因素对药物疗效的影响。本文试从分子生物药剂学的角度，阐明该学科对提高非病毒类载体转染效率的指导作用。

　　基因转染的生物学屏障

　　基因转染是指通过适宜的技术将目的基因输送到靶作用的部位。无论是体外转染还是体内转染，都必须克服一系列生物学的屏障。在体外，高水溶性、负电性质的核酸大分子首先要跨过同样带负电但具有脂质体双分子层结构的细胞膜，即细胞膜屏障；其次，微粒通过内吞作用进入内体或溶酶体，如何有效使复合物最大限度地从内体中释放，并保证药物不被溶酶体酶降解，则是转染的第二道屏障；最后，已释放出的DNA还要完成从胞浆到核孔的转运到达核内才能实现目的基因的表达。在体内，基因转染还需要解决靶向性和克服体液内环境等问题：即如何将基因药物从注射部位定向地输送到病变的组织和细胞，并且能够有效维持药物在体内的稳定性和最低限度地降低各种调理素对基因转染的影响。

　　目前，对非病毒类载体的研究内容就是针对基因转染的各种生物学屏障，以增加转染效率，提高复合物的生物稳定性，增强组织和细胞的特异性，降低载体的毒性等，从而为临床的基因治疗提供一种安全、高效的载体技术平台。

　　非病毒类载体转染效率的提高

　　在分子生物药剂学的指导下，结合其他学科理论，人们已经对非病毒类载体介导的基因转染机制有了更深层次的研究，使得用于解决或改善现有非病毒载体不足之处的手段愈来愈多。

　　新材料的合成迄今为止，实验室或临床阶段取得成功的非病毒类载体其“核心零件”部分的材料结构上都含有一个或多个氮原子基团，利用氮原子在生理条件下质子化而带正电荷，进而吸附DNA。因此，多数研究者仍以这一思路为主线，有目的地合成不同阳离子材料作为基因传递体统。

　　以阳离子脂质体为载体介导的基因传递已获得普遍的应用。常用的阳离子脂质材料有N-[1-（2，3-二油基氧）丙基]-N，N，N，-氯化三甲铵（DOTMA）、1，2-二油酰-3-三甲铵基丙烷（DOTAP）、3β[N-（N’,N’-二甲氨基乙基）氨甲酰基-胆固醇（DC-Chol）等。但人们在体外研究发现：同样是阳离子的脂质，其转染效率与载体压缩DNA的能力有关。由于上述几种阳离子脂质体均为单价的阳离子，通常不能有效地压缩DNA，为此，人们又合成了结构中含多价阳离子的脂质材料，以更有效地压缩DNA，提高转染效率。

　　水溶性的阳离子聚合物作为基因的载体具有操作简单、稳定性好的优点，溶于水后直接与DNA的溶液混合即可进行转染，历来是材料合成的重点研究对象。最早使用的材料是聚左旋赖氨酸（PLL），但现在已经很少单独使用，一方面主要是由于毒性太大；另一方是转染效率低，虽然PLL能够有效压缩和运载DNA，但进入内体后，由于结构中所含的氮原子在生理条件下即全部质子化，因此无法将药物从内体中释放出来，进一步则被溶酶体酶降解。根据这一特点，人们有针对性地合成了在生理条件下仅部分质子化的阳离子聚合物———聚乙烯亚胺（PEI）。

　　材料的结构改造到目前为止，可用作非病毒类载体进行基因给药的材料种类并不多，因此，类似于药物研发过程中的“先导化合物”的思路，人们更多的研究思路是在原有的材料基础上，通过结构修饰或化学改造，以改善原载体的性能。

　　如对DC-Chol（I）的侧链进行结构改造，可得到一系列的阳离子胆固醇衍生物，具有各不相同的转染效率：将极性头部与氨基甲酰基之间的连接键增加一个碳原子数目（II），转染效率可提高两倍；把侧链与载体甾体母核的连接键以酰氨基替代氨基甲酰基（III），转染效率又进一步提高近两倍。此外，极性头部的氨基取代基对转染效率影响更为显著：增加取代基的碳原子数目，转染效率显著下降；但用羟乙基单取代代替原来的N，N-二甲基，得到产物（IV）的转染效率是所有胆固醇衍生物中最高的。

　　进行配体修饰为了使药物能够有效地输送到靶器官，可以将能与靶组织特异结合的配体连接至药物的传递系统上，以提高靶组织的药物浓度。这一新型的药物传输理论也指导着基因给药。可用于基因给药的配体包括多肽、糖、蛋白等，如靶向肿瘤的配体有叶酸、转铁蛋白等，靶向肝细胞的配体有半乳糖、去唾液酸糖蛋白等。配体可以直接与药物载体连接，但最常用的是通过聚乙二醇（PEG）链与载体共价相连，既能达到靶向目的，又能起到亲水性的屏蔽性能。

　　提高胞内转运从靶向水平上来看，基因给药属于三级靶向，即细胞内靶向。而微粒给药系统通常主要以内吞途径进入细胞，细胞膜吞入微粒体后首先形成吞噬体，再与一个或多个溶酶体融合形成次级溶酶体。在溶酶体中，微粒被溶酶体中的酸性水解酶水解，同时也使药物降解、损失。所以，若能提高微粒从内体或溶酶体中完整释放，也是增加基因转染的有效途径之一。

　　目前国外公司推出的许多脂质体转染试剂，处方中除含有阳离子脂质外，类脂组成均含有一种称之为“脂质伴侣”的成分———二油酰脂酰乙醇胺（DOPE），它在基因转染过程中起着非常关键的作用。在酸性环境中（如溶酶体中），DOPE的分子构形发生变化，由Lα相转变为六角相。这一相变过程直接诱导了脂质体膜与内体膜融合，从而迅速释放DNA。

　　除上述DOPE的相变转化和前已提到的PEI的质子泵作用外，还可以采用亲溶酶体的试剂或膜激动剂，以提高药物在胞内转运的效率。

　　增加细胞核的摄取从内体或溶酶体中释放出的DNA还必须完成到核内的转运，才能表达出相应的产物。目前对于细胞核的转运研究尚不明确。现研究认为：DNA、蛋白等大分子不能够透过核膜，其核转运是通过核孔，即形成核孔复合物。转运机制是载体介导的主动转运，这一过程需要有特定的信号参与。因此，近来提出了核定位序列的概念（NLS），其本质是来源于非病毒类载体的强启动子和转录因子，如GAL4、SV-40等，这也是病毒类载体的转染效率高于非病毒类载体的原因。在非病毒类载体的设计中，可以将这些信号分子直接构建于DNA质粒载体中，或通过化学键合将这些信号分子所表达的多肽修饰至DNA，也可以直接先于DNA混合，再通过静电的作用与阳离子载体复合。

　　今后对非病毒类载体的研究突破一方面取决于药剂学、高分子材料学、细胞生物学、物理学等学科的发展速度；另一方面也取决于对基因转染的分子水平机制研究的深入程度，而这些都必将丰富和完善分子生物药剂学的知识和理论。可以预计：分子生物药剂学这门融合多方面知识的学科，在今后基因治疗的非病毒类载体设计中将日益显示出其重要价值。