重大发现：胚胎发育时端粒修复 有望解决动物克隆技术难题

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生物通快讯：染色体保护性端粒的缩短被认为是克隆健康的哺乳动物的一个主要障碍，但科学家还不能确定发育中的胚胎是如何控制端粒的长度的。发表在5月17日的Proceedings of the National Academy of Sciences上的有关小鼠和牛的克隆研究报告为解决克隆过程中这一难题带来一线曙光。

染色体的末端是具有特殊结构、有保护作用的端粒，是维持染色体结构稳定的重要因素，由一段具有特定重复序列的DNA和端粒结合蛋白组成，细胞每分裂一次，他们就会变短一些。当端粒缩短到一定临界长度时，染色体结构就容易发生突变而导致细胞进入衰老期并以死亡而告终。有人认为，染色体端粒可能是导致细胞衰老的决定因素之一，也可能是导致一些和年龄有关的疾病的原因之一，如动脉硬化和某些癌症。 

作为一种保护机制，端粒酶(telomerase)存在于像卵、精子和干细胞这类细胞中，负责修复和维持端粒的长度（端粒DNA的复制不是由DNA聚合酶完成的，而是由端粒酶(telomerase)催化合成后添加到染色体的末端，生物通网站注）。但是，当发育完成后，端粒酶在成熟细胞中失活（如果在成熟细胞中的端粒酶重新激活，端粒DNA随分裂活动发生渐进性缩短的趋势受到阻遏，就会使正常细胞转化成具有无限分裂能力的永生化恶性细胞，生物通网站注）。物种克隆技术中一个不难预料的危险是，来自成熟细胞中几经细胞分裂已经缩短的端粒（连同成熟细胞染色体一起）代替了卵细胞中的正常端粒，事实上这种成熟细胞的克隆的端粒都比正常细胞的端粒要短些。 

为进一步了解在细胞融合和成熟过程中克隆动物的端粒可能发生什么问题，由德国Hannover 医学院和Heiner Niemann 动物科学研究所（at Mariensee）的 Lenhard Rudolph（Germany）领导的研究小组对发育过程中的端粒长度进行了追踪调查。通过比较正常受精、体外受精、以及克隆技术得到的小鼠和牛胚胎，他们发现发育中的胚胎可以修复较短的端粒。 

无论来源于哪里的DNA，一旦胚胎进入囊胚（blastocyst）和桑葚胚（morula）之间的发育阶段，端粒酶就会将端粒修复至正确的尺寸。在端粒酶基因缺失的胚胎中，所有胚胎的端粒都比正常的端粒短。 

这一研究揭示了在“发育阶段的关键时刻”克隆胚胎中缩短的端粒得到修复，Spanish National Cancer Center （in Madrid, Spain，生物通网站注）的一位分子生物学家 Maria Blasco说。为什么某些克隆出的动物仍然是较短的端粒？Blasco怀疑，克隆能够导致DNA的化学修饰，可能阻碍了端粒酶对端粒的结合或者修复。

背景（生物通网站提供）：克隆动物会不会早衰？

多利羊猜想 

　　大家知道，用来克隆多利羊的母羊有6岁，那么多利羊的生理年龄是从6岁开始累计呢，还是像新生羊那样从零岁开始累计？这一涉及克隆动物是否早衰的问题可形象地称为“多利羊猜想”。 1996年7月5日诞生的克隆羊多利的一举一动都为世人关注。1999年5月27日，培育多利羊的英国PPL医疗公司和罗斯林研究所科学家组成的一个研究小组宣布，多利的染色体端粒长度比同年龄普通绵羊要短。当时认为，这可能是用成年绵羊的细胞克隆“多莉”造成的，使其细胞具有成年细胞的印记。这意味着多利可能会比普通绵羊更快地走向衰老和死亡，表明了现有克隆技术的局限性。 2001年多利被发现患有关节炎。这引起了人们对克隆动物健康问题的新关注。研究人员不能确定多利患病的原因究竟是克隆过程造成的遗传缺陷，还是纯属偶然，这件事情可能永远也弄不清楚。不过，多利在其他方面健康状况良好，并已生育了6只健康的小羊羔，研究人员将继续密切关注它的健康。多利也常在电视上露面，它看上去状态良好，很有活力。 

　　不同声音 

　　科学家宣布多利羊出现早衰迹象之后，全世界对这一问题并没有拿出确凿的证据证明是否所有克隆动物都会早衰，也没有证明多利是否只是一个早衰特例，甚至也没有证明多利羊肯定会早衰。出现这种现象的主要原因是克隆动物太少，而且对此进行研究也需要一定的时间。

    不过一年多后，美国洛克菲勒大学的科学家宣布，他们在培育出连续6代克隆鼠后发现，克隆动物的染色体端粒不一定比正常动物更短，因而未必会早衰。克隆技术是否会导致健康方面的缺陷，还需要做进一步研究。 美国科学家采用细胞核移植技术，用成年鼠的体细胞培育克隆鼠，并在克隆鼠的基础上继续克隆，总共成功培育出6代克隆鼠。由于唯一的一只第6代克隆鼠被其他实验鼠吃掉，实验被迫中止。前5代克隆鼠的健康状况正常，并未表现出早衰迹象。如果克隆技术会导致健康缺陷，这些缺陷在下一代克隆鼠身上应当表现得更为明显。但人们发现，克隆鼠的染色体端粒长度不但没有异常缩短，相反的是，每一代克隆鼠的端粒长度都比上一代稍长一点。这表明，克隆过程并不一定会导致端粒缩短。每一代克隆都比上一代更加困难，总体成功率只有1％至2％。

    美国马萨诸塞州的医生罗伯特·兰扎等用培养的衰老细胞克隆牛，得到6头小牛，出生5～10个月后发现这些克隆牛的端粒比普通同龄小牛要长，有的甚至比普通新生小牛的端粒还长。现在还不清楚这一现象的原因，也不清楚为何与“多莉“的情况有巨大差别。但这一实验说明，在一些情况下克隆过程能改变成熟细胞的分子钟，使其“恢复青春”，关于这种变化对克隆动物寿命的影响，还有待于进一步观察。

    日本小仓淳郎在1999年3月至9月间，使用精巢体细胞培育出12只雄性克隆鼠，然后在同样条件下对它们和普通老鼠进行饲养，结果是，在出生后311天第一只克隆鼠死亡，在800天内，12只克隆鼠死去10只，而7只普通老鼠在800天内仅有1只死亡。体细胞克隆鼠的寿命要比一般老鼠短。这使得克隆动物是否早衰的争论又趋激烈。  


　　争论的焦点 

　　关于克隆动物是否早衰的争论大体分两派，一派认为，克隆动物的端粒比较短，克隆动物的基因不正常，克隆动物早衰是一个根本现象。另一派则认为，克隆动物的遗传物质是正常的，目前发现的早衰迹象是在克隆过程中出现的一些技术问题造成的，或者克隆动物在发育中出现了变异，早衰只是属偶然现象，也许有的变异使得克隆动物更加长寿。不过由于目前全世界的克隆动物较少，诞生时间都不很长，因此到目前为止这一问题尚未有定论。

克隆的早期研究

    克隆一词是英文单词clone的音译，作为名词，c1one通常被意译为无性繁殖系。同一克隆内所有成员的遗传构成是完全相同的，例外仅见于有突变发生时。自然界早已存在天然植物、动物和微生物的克隆，例如：同卵双胞胎实际上就是一种克隆。然而，天然的哺乳动物克隆的发生率极低，成员数目太少（一般为两个），且缺乏目的性，所以很少能够被用来为人类造福，因此，人们开始探索用人工的方法来生产高等动物克隆。这样，克隆一词就开始被用作动词，指人工培育克隆动物这一动作。

    目前，生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。克隆羊“多莉”，以及其后各国科学家培育的各种克隆动物，采用的都是细胞核移植技术。所谓细胞核移植，是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，经显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。与胚胎分割技术不同，细胞核移植技术，特别是细胞核连续移植技术可以产生无限个遗传相同的个体。由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，故人们往往把它称为动物克隆技术。

    采用细胞核移植技术克隆动物的设想，最初由汉斯·施佩曼在1938年提出，他称之为“奇异的实验”，即从发育到后期的胚胎（成熟或未成熟的胚胎均可）中取出细胞核，将其移植到一个卵子中。这一设想是现在克隆动物的基本途径。 从1952年起，科学家们首先采用青蛙开展细胞核移植克隆实验，先后获得了蝌蚪和成体蛙。1963年，我国童第周教授领导的科研组，首先以金鱼等为材料，研究了鱼类胚胎细胞核移植技术，获得成功。

    哺乳动物胚胎细胞核移植研究的最初成果在1981年取得——卡尔·伊尔门泽和彼得·霍佩用鼠胚胎细胞培育出发育正常的小鼠。1984年，施特恩·维拉德森用取自羊的未成熟胚胎细胞克隆出一只活山羊，其他人后来利用牛、猪、山羊、兔和猕猴等各种动物对他采用的实验方法进行了重复实验。1989年，维拉德森获得连续移核二代的克隆牛。1994年，尼尔·菲尔斯特用发育到至少有120个细胞的晚期胚胎克隆牛。到1995年，在主要的哺乳动物中，胚胎细胞核移植都获得成功，包括冷冻和体外生产的胚胎；对胚胎干细胞或成体干细胞的核移植实验，也都做了尝试。但到1995年为止，成体动物已分化细胞核移植一直未能取得成功。

克隆羊“多莉”的意义和引起的反响

    以上事实说明，在1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性，在分化过程中细胞核中的遗传物质没有不可逆变化；在实践上证明了，利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的，将有无数相同的细胞可用来作为供体进行核移植，并且在与卵细胞相融合前可对这些供体细胞进行一系列复杂的遗传操作，从而为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法。

     克隆羊“多莉”的诞生在全世界掀起了克隆研究热潮，随后，有关克隆动物的报道接连不断。1997年3月，即“多莉”诞生后1个月，美国、中国台湾和澳大利亚科学家分别发表了他们成功克隆猴子、猪和牛的消息。不过，他们都是采用胚胎细胞进行克隆，其意义不能与“多莉”相比。同年7月，罗斯林研究所和PPL公司宣布用基因改造过的胎儿成纤维细胞克隆出世界上第一头带有人类基因的转基因绵羊“波莉”（Polly）。这一成果显示了克隆技术在培育转基因动物方面的巨大应用价值。

    1998年7月，美国夏威夷大学Wakayama等报道，由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，这是继“多莉”以后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。此外，Wakayama等人采用了与“多莉”不同的、新的、相对简单的且成功率较高的克隆技术，以分化程度较低的卵丘细胞为核供体，这一技术以该大学所在地而命名为“檀香山技术”。

    此后，美国、法国、荷兰和韩国等国科学家也相继报道了体细胞克隆牛成功的消息；日本科学家的研究热情尤为惊人，1998年7月至1999年4月，东京农业大学、近畿大学、家畜改良事业团、地方家畜试验场以及民间企业纷纷报道了，他们采用牛耳部、臀部肌肉、卵丘细胞以及初乳中提取的乳腺细胞克隆牛的成果。至1999年底，全世界已有6种类型细胞——胎儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管／子宫上皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞的体细胞克隆后代成功诞生。

    2000年6月，中国西北农林科技大学利用成年山羊体细胞克隆出两只“克隆羊”，但其中一只因呼吸系统发育不良而早夭。据介绍，所采用的克隆技术为该研究组自己研究所得，与克隆“多莉”的技术完全不同，这表明我国科学家也掌握了体细胞克隆的尖端技术。

    在不同种间进行细胞核移植实验也取得了一些可喜成果，1998年1月，美国威斯康星一麦迪逊大学的科学家们以牛的卵子为受体，成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎，这一研究结果表明，某个物种的未受精卵可以同取自多种动物的成熟细胞核相结合。虽然这些胚胎都流产了，但它对异种克隆的可能性作了有益的尝试。1999年，美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物盘羊的胚胎；我国科学家也用兔卵子克隆了大熊猫的早期胚胎，这些成果说明克隆技术有可能成为保护和拯救濒危动物的一条新途径。

今年4月份世界首只单性繁殖小鼠：辉夜姬的诞生意味着克隆技术进入新的时代。