重大突破：能利用22种氨基酸合成蛋白的细菌

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生物通讯：加利福尼亚州Scripps Research Institute及Skaggs Institute for Chemical Biology in La Jolla的一个研究小组对一种大肠杆菌进行修饰，使其能够利用22种氨基酸的遗传密码。

“我们已经证实，两个人造氨基酸能够同时结合到同一个多肽中去”，Scripps化学研究的负责人Peter G.Schultz博士说。 “我们现在知道遗传密码可以扩展到22氨基酸，接下来的问题是我们最多可以扩展到多少？”

在即将发表的期刊Proceedings of the National Academy of Sciences中，这个研究组叙述了他们如何对E. coli进行改进以产生具有22种氨基酸的肌球蛋白，即除了天然存在的20种氨基酸，还结合了人造氨基酸O-甲基－L-酪氨酸（O-methyl-L-tyrosine，生物通注）和L-同型谷氨酸（L- homoglutamine，生物通注）。

数年来科学家一直致力于在实验室中合成含有这种人造氨基酸的蛋白质，但直到Schultz和他的同事若干年前开始这一领域的研究为止，还没有人找到能将人工氨基酸加入到有机体遗传密码中的方法。Schultz的团队早期的研究描述了一些在化学和生物学中具有多种用途的单个的人工氨基酸结合到E. coli和酿酒酵母中的成果。 

最近的研究成果极为有用，因为它证明了多个人造氨基酸能被加入到同一种被修饰过的有机体的遗传密码中。这个原理验证阶段（proof-of-principle，生物通注）的工作为在同一个生物体中同时合成含有3—个4甚至更多新氨基酸的蛋白的研究打开了大门。

为什么要扩增遗传密码？
我们知道，生命在分子水平上是有相同的基本单位构成。例如，地球上所有的生命形式都是使用同样的四个碱基形成DNA。并且，我们所知道的所有生命形式很少有例外地都是利用相同的20种氨基酸（也是仅有的20种）去合成蛋白质。

问题是为什么氨基酸的数量就停止在了20上，为什么独独选择了20？
虽然这个问题很难回答，但是20种氨基酸障碍却不是绝对的。事实上，在某些罕见的例子中，某些有机体发展了利用人造氨基酸硒氨酸（selenocysteine，生物通注）和吡咯赖氨酸（pyrrolysine，生物通注）的能力，这两种氨基酸是将半胱氨酸和赖氨酸进行略微修饰的产物。 

除了这些罕见的“例外”，科学家努力去寻找在试管中和活细胞环境中将人造氨基酸结合到蛋白质中的方法，因为这些新颖的蛋白质在生物医学基础研究中有很大的利用价值。它们为研究和掌握一些基础的生物学进程提供了一个强有力的工具，特别是现代生物物理学和细胞生物学领域中一些最迷人的问题，包括细胞内信号传导和蛋白运输，以及蛋白折叠、蛋白质相互作用等等。 

例如，有些新氨基酸含有荧光基团，可以用于合成带有荧光标记的蛋白以便在活体中进行观察。这在目前尤其有用武之地，因为人类基因组组成问题已经得到解决，而科学家正将他们的注意力转移到基因在细胞中具体功能的问题上来。另外一些人造氨基酸含有光亲和标签（photoaffinity labels，光活化基团，生物通注）和其他的“交联”基团，可以用于示踪蛋白质间的相互作用，在细胞内将相互作用的蛋白结合起来。纯化这些连接在一起的蛋白有助于让科学家了解活细胞中相互的蛋白——即使那些运用目前的方法难以检测到的弱相互作用。 

人工氨基酸在医药也有重要意义，许多用于治疗的蛋白质需要对其进行修饰，例如添加聚合体（polymers，生物通注）、交联剂（crosslinking agents，生物通注）和细胞毒分子（cytotoxic molecules，生物通注）等化学基团进行修饰。去年，Schultz 和它的Scripps Research同事研究结果揭示糖基化氨基酸（glycosylated amino acids，生物通注）可以结合到特定位点，合成糖基化蛋白——一这是制备某些药物的重要步骤。 

新型的疏水氨基酸、重金属结合氨基酸和含有spin labels的氨基酸对检测他们所插入的蛋白的结构是很有用的。而且，含有类似“酮基”的基团可以用于添加耦联其他化合物分子例如糖类，而糖分子与具有治疗功能的蛋白质的产生、活性有关。

Schultz和他的同事通过利用多出来地遗传密码成功地构建出22种氨基酸E. coli。在转录的过程中，酶阅读基因的DNA碱基（A、G、C、Ｔ），并将其转录成RNA（A、G、C、U）得到的“信使RNA”接着被另一种称为核糖体的蛋白质和RNA复合体翻译成蛋白质。核糖体需要转运RNA分子（tRNA）的协助，每个tRNA装载有不同氨基酸分子，当然这还需要一种“装载”酶的帮助。每个tRNA分子识别位于mRNA上的一种独特的三联密码子，并装载上与密码子相对应的一个氨基酸。 在蛋白质合成中，与mRNA上下一个密码子相对应的tRNA装载着正确的氨基酸到达其正确位置时，核糖体将氨基酸加入到正在延伸的蛋白质链中。

遗传密码的富余是由于可能存在的密码子数量多于氨基酸能利用到的数量。事实上，4个碱基有64种可能的组合形成密码子（4x4x4），或者说在mRNA中由四种字母任意构成的三联体密码有64个。有机体只利用仅仅20种氨基酸，因此不是所有潜在的密码子组合都是必须的。但自然无论如何也是会利用它们的。部分多余的密码子编码同一个氨基酸，并且它们中的三个是无意密码子——它们不编码任何氨基酸。

这些无意密码子是有用的，因为正常情况下，当合成蛋白质的核糖体到达一个无意密码子时，核糖体就会从mRNA上解离出来，合成也就终止了。因此，无意义密码子也被称为终止密码子。它们中的一个，即琥珀终止密码子UAG在Schultz的研究中扮演了一个重要角色。 

Schultz 和他的同事知道，如果他们能给细胞提供一个能够识别UAG的tRNA分子，并提供一个特殊的能将人工氨基酸装配到tRNA上所需的合成酶的话，科学家就有机会将人工氨基酸插入到他们需要的蛋白质的特定位点。他们需要找出一对能够相互作用tRNA/合成酶，然而又不和大肠杆菌中的其他内源tRNA/合成酶交叉作用。因此，他们设计出一个方法去改造一个合成酶的特异性，使之能选择性地接受人工氨基酸。 

以甲烷球菌（Methanococcus jannaschii，生物通注）的tRNA/合成酶对为材料，他们构建了一个E.coli细胞库，每个带有一个突变地甲烷球菌合成酶，他们改变了酶的特异性，从而可以利用来识别人工氨基酸O-甲基－L-酪氨酸。

研究人员先设计了一种正筛选实验，只要orthogonal tRNA能代上任意一种氨基酸的大肠杆菌就能存活。然后再设计一个负选试验，识别UAG的tRNA携带的氨基酸如果不是O-methyl-L-tyrosine，那细菌就会死。通过两个实验，研究人员找到了仅识别人工氨基酸的orthogonal tRNA和对应和合成酶突变体。在这种大肠杆菌中，当核糖体在读mRNA时遇到UAG就会将人工氨基酸O-methyl-L-tyrosine插入正在合成的蛋白肽链中。由于一个mRNA上任意密码子突变为UAG后，翻译得到的蛋白质的相应位点上就会插入新的氨基酸，这使得研究人员可以在大肠杆菌的蛋白合成中定点插入新的氨基酸。

同样的方法，研究人员利用极地古细菌Pyrococcus horikoshii构建出可以识别AGGA.的一对改造的tRNA/合成酶。tRNA有一个4个碱基的反密码子环，当E. coli细胞中的核糖体阅读mRNA时遇到AGGA，它就会将人造氨基酸L-homoglutamine插入到这一位点。将两套系统置入同一E. coli细胞中, Schultz和他的同事证实了这种技术可能性。这使得将来进行更多点的人工氨基酸替换成为可能。

这篇"A twenty-two amino acid bacterium with a functional quadruplet codon"文章的作者是J. Christopher Anderson、 Ning Wu、Stephen W. Santoro、Vishva Lakshman、David S. King和Peter G. Schultz，文章于本周公布在Proceedings of the National Academy of Sciences网上。网址是http://www.pnas.org/cgi/content/abstract/0401517101v1. 文章将于今年晚些时候正式发表在印刷版上。

这一工作得到了能源部和Skaggs Institute for Research的支持。从事这项研究的科学家得到National Science Foundation Predoctoral Fellowship、Canadian Institutes of Health Research fellowship和一项来源于Burroughs Wellcome Fund的生物化学领域的奖金的赞助。

The Scripps Research Institute in La Jolla是世界上最大的、私人的、非盈利的生物医学研究组织之一，致力于基础生物医药科学中的最基础的生命进程的前沿研究。Scripps Research因其在免疫学、分子生物和细胞生物学、化学、神经学、免疫系统疾病、心血管疾病和疫苗合成方面的研究成果而在世界范围内得到认可。