超越PCR的新DNA重组技术

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    [生物通讯]研究人员透露，随着一种克服了现有DNA操作固有局限的新技术的产生，DNA工程将变得更为简易、快速和准确。至少已有两组研究人员开发出λ噬菌体介导的控制大肠杆菌Escherichia coli 同源DNA重组的特性以克服这些问题的技术。

    新技术的开发者认为，这项新技术是自PCR技术产生以来DNA工程中最为重要的进展。首先上市的是由欧洲分子生物学实验室的Francis Stewart 和Youming Zhang研制出的Red/ET DNA重组技术。二人接下来又联合成立了Gene Bridges股份有限公司来商品化这项技术，公司并于今年3月获得了这项技术的美国专利。

    起初，遗传工程师们是依靠限制性内切酶和DNA连接酶来剪切和粘贴DNA片断。由于这些酶的剪切位点相隔约250-4,000个碱基对左右，因而这些技术仅局限于小片断。个别剪切酶的剪切片断可达到50kb，但体外连接这些酶还是一个问题。

    PCR技术的问世减少了对限制性内切酶的依赖性，但扩增长度大于10kb的DNA片断非常费力。PCR技术的准确度也较低，扩增大片段时该问题尤为严重。

    “应用Red/ET 技术，我们可以获得“高保真”的DNA片断，至少200kb。”Stewart说。“这项技术比PCR技术具有更高的准确度，因为该技术是利用大肠杆菌内在的复制机制来复制DNA的，因而可以象克隆技术一项忠于‘原创’。”

    Red/ET重组技术可以通过噬菌体衍生的一对蛋白在大肠杆菌体内操作DNA，蛋白对或是rac 原噬菌体的RecE/RecT蛋白对，或是λ噬菌体蛋白Red alpha 和 Red beta。（Red alpha/RecE是核酸外切酶，Red beta/RecT则是DNA退火蛋白。）

    Red alpha沿着DNA单链断裂的一端反向剪切，剩下另一条完整的DNA单链。Red beta与单链DNA结合，这一复合体具有发现和稳定结合基因组中任何与单链DNA互补的序列的特性。这一反应在大肠杆菌染色体、质粒或细菌人工染色体(BAC)中都可进行。一旦结合，Red beta/DNA单链复合体就可以行使类似DNA复制时的引物的功能，使引入的DNA连接到大肠杆菌细胞复制机器中的目标区域。这项技术及其应用方法在其它著作中有详细全面的介绍。

    Stewart表示，Red/ET重组技术可用于插入、剔除或替换目标分子任何部位的DNA序列。该技术还可用于直接亚克隆或克隆DNA复杂的混合体的序列，而无需对DNA进行纯化，也不需要选择合适的限制性内切位点。Stewart透露，这个“重组工程”早先曾在酵母细胞中进行过，但利用大肠杆菌更为便利。

    该技术的各种用途已得到认证，现已在学术和产业领域使用。Gene Bridges公司公司本身也提供DNA工程服务，客户可将DNA样品送至实验室进行修饰。“应用常规技术需要16周甚至更长的时间，而我们只需2到4周就可完成，且价格仅是常规技术的三分之一。”公司的业务发展部经理Michael Spiegel,说道。目前公司的主要客户包括Aventis等大公司。这项技术还可购买使用权。学术机构可以购买低成本的Red/ET试剂盒和质粒而无需支付授权许可费用。

    “这项技术的功能十分强大。例如，它已成为大肠杆菌染色体遗传工程的可选方法。”Stewart 说。

    该技术另一重要应用领域是在小鼠遗传学，包括创建各种人类疾病的小鼠模型。早先，插入到小鼠中的转移基因仅限于15kb。由于基因是如此之小，它们在基因组中的活动难以预测。而应用Red/ET重组技术，转移基因可以涵盖在一个大的DNA插入片断中，这样操作起来就更为准确无误。德国癌症研究中心的Günter Schütz已利用该系统创建出转基因小鼠，他表示该技术使转基因过程更为简单快捷。

    另一个探索λ噬菌体噬菌体介导的重组工程尖端技术的是来自美国国家癌症研究院的Donald Court 实验室。该实验室也持有这一领域的美国专利，但他们的技术还没有商品化。根据Court，国家癌症研究院的系统重组效率极高，Red/ET需要的两步操作在他们的技术中只需一步。

    “我认为同源DNA重组技术将取代克隆中使用的限制型内切酶和连接酶。”Court预言。“这很简单：我们只要有了寡核苷酸和PCR产物，一切都可以在细胞内重组。目前最大的障碍就是没有足够的公司将这一技术推向市场。”

    Court 相信，最终这一技术将会用于其它生物体及其伴随的病毒。这将省去对大肠杆菌的需要，允许DNA操作直接在小鼠或人类细胞中进行。

生物通摘译自BioMedNet