Cells to cDNA:从微量细胞中直接制备cDNA[新品推荐]

  对于细胞数量非常有限的样品来说，定量RT-PCR（Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）是研究其中基因表达模式的常用方法。然而，由于样品量少或者非常珍贵，在纯化过程中的样品损失和产率的影响尤为关键，因此少量细胞的RNA的分离纯化成为令人困扰的问题。比如大鼠背根神经节只有米粒大小，要用常规的方法纯化RNA，需要杀死大量的大鼠来获取足够数量的样品；如果样品是昆虫（比如蚊子）的某个器官，要获得足够的样品，需要的工作强度可想而知；如果样品是某种微小的、不常见的寄生虫，要获得足够样品的难度就更大了。

  由于激光显微俘获系统（Laser Capture Microdessection, LCM）的出现，研究人员现在可以在一张切片上抓取真正的癌细胞进行研究，不必象以前那样用混合正常细胞和癌细胞的组织块进行分析，真正意义上提高了结果的真实性。然而在一张切片上抓出来的细胞能有多少？如何纯化几个细胞的RNA？

  RNA领域的专家，号称“the RNA Company”de Ambion公司推出的Cells-to-cDNA II是其中的解决方案之一：跨过RNA纯化步骤，直接在细胞裂解液中分析结果。只需要不到2个小时的时间，可以从少至1个细胞，多到12500个细胞中制备出可直接用于PCR的cDNA——这些细胞可以是新鲜组织，也可以是LCM从切片上抓取出来的细胞，包括石蜡固定的细胞；试剂盒的操作流程很简单，可以应用于96孔板甚至自动化操作；制备cDNA的方法可以根据实验需要选择一步法RT-PCR或者两步法RT-PCR。更重要的是，用试剂盒处理的结果相当稳定可靠，在1到10000个细胞的范围内有非常良好的线性关系。

  操作过程很简单：在搜集有样品的管中加入细胞裂解液，75度保温10分钟，裂解液中的成分立即使样品中的RNAse失活并“固定”样品中的RNA表达模式，同时裂解细胞。加入DNase I除去基因组DNA，加热失活后的裂解液即可用于反转录实验。

  Cells-to-cDNA II由于改良了裂解液的配方，使得裂解能力提高25倍，能够处理更多种类细胞，使得试剂盒的应用范围更宽、操作条件粗放、易于优化，可用于自动化操作。试剂盒提供从细胞中释放RNA、稳定RNA、消化DNA和合成cDNA的试剂。详细信息参看生物通商城。

 

微量样品的实时定量分析

  两步法的real-time RT-PCR是定量分析样品中基因表达状况的最常用的方法之一，适用于各种细胞类型以及各种规模的样品量。实验用培养的Hela细胞经胰酶处理、计数、洗涤后用PBS按级数稀释成不同的浓度，每个稀释度取5微升，加入95微升Cells-to-cDNA II 裂解液，使得最后细胞的终浓度为1个/微升到10000个细胞/微升不等。按照标准操作流程处理，最后每个稀释度样品取5微升裂解液，在20微升反应体系中进行反转录反应。反应结束后各取5微升cDNA作GAPDH TaqMan qRT-PCR分析（ABI 7700），扩增曲线如图。用极限循环数（cycle threshold,Ct)对细胞浓度作图，得到的标准曲线相关性达0.99。可见，在1—10000个细胞的范围内，Cells-to-cDNA制备的cDNA在实时定量RT-PCR中可得到线性的结果。值得注意的是由于彻底除去基因组DNA，对照的结果是阴性的。

Figure 1. Cells-to-cDNA™ II is Compatible with Two Step Real-time RT-PCR. Cell lysates containing 1 to 10,000 HeLa cells/µl were prepared using Cells-to-cDNA II. These lysates were subjected to two step real-time RT-PCR using primers and a TaqMan® probe for GAPDH. A) Amplification curve. B) The standard curve of Ct value vs. cell concentration. The correlation was 0.99

  Cells-to-cDNA II同样适用于一步法RT-PCR的实时监测。同样的的方法将细胞稀释到1—2500个细胞/微升，各取5微升细胞裂解液，在25微升体系的一步RT-PCR反应，用GAPDH TaqMan引物，ABI7700程序设定42度15分钟作反转录反应，然后是40个循环PCR。共用时1小时40分，结果同样显示在1—2500个细胞/微升的范围内可得到线性结果。这表明Cells-to-cDNA II适用于one step qRT-PCR，这一点在有大量样品需要进行分析，需要进行自动化操作时就显得很重要。

Figure 2. Cell Lysates are Compatible with One Step Real-time RT-PCR. HeLa cell lysates of 1 to 2,500 cells/µl were generated using the Cells-to-cDNA™ II protocol. The cell lysates were used directly in one-step RT-PCR and analyzed by real-time PCR for GAPDH using the ABI 7700. The inset is the standard curve of Ct value v. cell concentration. The correlation was 0.99.

　

用福尔马林固定的细胞和激光显微切割俘获系统（LCM）抓取的细胞作为样品

  用培养的Hela细胞经PBS洗涤、1%福尔马林，4度下固定1小时，洗去残留的固定液，按不同浓度稀释（4—2500/微升）并加入Cells-to-cDNA II裂解液，并以同样浓度的未处理培养细胞作为对照，最后进行GAPDH 2步法RT-PCR。结果显示，未固定的细胞和固定处理的细胞的Ct值相差不大，显示Cells-to-cDNA II可以处理经过固定和免疫染色的细胞，因而可以用于经过流式细胞仪筛选的细胞，作定量分析。

Figure 3. Cells-to-cDNA™ II is Compatible with Fixed Cells. HeLa cells fixed with 1% formalin and then processed using the Cells-to-cDNA II procedure generated almost identical Ct values for GAPDH as untreated cells. This was true up to 2,500 cells/µl of cell lysate.

　

  激光显微切割俘获系统已知是非常有用的分离特定细胞的工具。在实验中以OCT包被的小鼠肝脏冰冻切片经苏木精—曙红（H—E）染色，厚度5—10um，用Arcturus Pixcell II系统取0.16、0.36、0.64mm²大小的组织样品，用Cells-to-cDNA II处理后均能在一步RT—PCR反应中实时监测GAPDH信号。

　

自动化操作从细胞中直接制备cDNA

  以高通量的模式检测众多样品中基因表达的变化，很可能是不远的将来的一种趋势。Cells-to-cDNA II能够适用较为粗放的条件，因而也同样能够用于自动化操作平台上。由于Cells-to-cDNA II不需要磁铁、不需要酚氯仿处理和离心（或者真空抽滤），因而非常适合高通量自动化操作。由于已知PMA（phobol myristate acetate)可以促进人上皮细胞中tPA（tissue plasminogen activator）的水平，实验将Hela细胞接种也96孔板，按不同浓度加入PMA，细胞在37度温育24小时后在Packard公司的MultiPROBE II robot上用Cells-to-cDNA II进行直接制备cDNA。Parkard自动操作系统设定取5微升裂解产物在96孔板中进行一步RT-PCR反应，同时加入TaqMan探针和引物，对tPA和 18S rRNA（作为内参照）进行检测。经过内标均一化后结果显示：PMA处理后tPA的mRNA丰度提高了29倍。

Figure 4. Automating the Cells-to-cDNA™ II Protocol for Drug Induction Studies. Analysis of tPA induction by PMA in HeLa cells using Cells-to-cDNA II and the Packard MultiPROBE™ II from PerkinElmer. HeLa cells were grown in 96 well plates and incubated with different concentrations of PMA for 24 hours. Cell Lysis Buffer was added directly to the 96 well plate and then processed according to the Cells-to-cDNA II protocol. Cell lysates were used directly in one-step RT-PCR analysis of 18S rRNA and tPA. Panel A. Relative tPA values before normalization against 18S rRNA signals. Panel B. Corrected tPA values after normalization with 18S rRNA.

　

  当样品量非常稀少时，从细胞中直接得到的cDNA量也非常有限，通常要进行已知基因的表达模式的分析是可行的，但是要进行全局RNA表达模式分析就不够了。以前我们总是想方设法弄到更多的样品，或者寻找更好的反转录酶提高反转录的效率，当Clontech公司推出SMART cDNA合成试剂盒时我们又开始用PCR的方法扩增文库，实际上我们往往忽略了一个简单有效，比PCR更能真实保留cDNA丰度的办法——RNA体外扩增。

  其实RNA体外扩增比PCR简单：只要在反转录反应中，加入带有T7（或者T3、SP6）启动子序列的Oligo（dT）作为反转录的引物，合成的cDNA中就带有T7启动子，就可以直接进行体外转录反应。由于体外转录是线性扩增，而不是几何级数扩增，不会将原有RNA之间的差别级数放大，好的试剂盒可以将RNA信号放大1000倍而依然较好的保留原有的丰度模式。得到的cRNA或者aRNA可以直接用于标记作探针，或者进一步放大。生物通将陆续介绍介绍有关的产品。