基因表达谱----中医药功能基因组学研究的思考

　　

人类基因组计划自1990年启动以来，经过6国科学家10年余的努力，已提前完成了构建人类基因组遗传连锁图、物理图和序列图。2001年2月12日中、美、日、德、法、英等6国科学家和美国塞莱拉公司联合公布人类基因组图谱及初步分析结果，人类基因组共有32亿个碱基对，包含了大约3万到4万个蛋白编码基因。Science和Nature还专刊出版了人类基因组研究的详细信息。至2001年10月15日，在GenBank报告的基因座序列已达13,602,262个，约有14,396,883,064个碱基。然而，结构基因组研究的成果只能告诉人们基因组的结构特征和序列信息，这些信息仅仅是理解生物体功能的起点。随之而来的是更为艰巨和复杂的“后基因时代”,一个以破译、解读、开发、调节基因组功能为主要研究内容的“功能基因组学”时代的开始,21世纪是生命科学的世纪。

1 基因科学给中医药发展带来机遇

基因科学带给医学的变化将是革命性的,有人称“基因科学导致医学革命”。 国际人类基因组计划总协调人、美国国家人类基因组研究中心主任弗朗西斯·柯林斯博士称,到2010年,任何人都可通过基因检测来估计有碍自身健康的主要危险,如对烟酒的耐力,还能了解自身对各种治疗方法的反应如何。50年内以基因组学为基础的综合卫生保健在美国将成为平常事,在许多情况下可以预防疾病,并设计出个性化的治疗方法。人类基因组图谱绘制完成之后,科学家们将深入认识各种疾病基因,以及这些基因同其它基因和环境的相互作用。

现代医学正在迎头赶上,通过功能基因组学研究,着手于编制各种疾病的基因表达谱,从诊断上便于基因检验;从治疗上来讲,按孟德尔规律遗传的单基因病比较适合于改变基因结构的治疗,但迄今为止,基因治疗并不成熟,其负面效应还不清楚,况且以不可逆转的方式改变人类基因组,是科学家最大的远虑。绝大多数发病率高、危害性大的疾病是多基因病,如高血压、心脑血管病、哮喘病、风湿病、骨质疏松、神经精神病等属于多种功能基因调控失常所致,更不适宜于基因治疗。因此对疾病的治疗,不管在现在还是在将来,都将从调控基因的功能着手,即从修饰或改变基因的表达与基因产物的功能着手,而不是以改变与纠正基因的结构为主要手段。

基因科学的迅速发展,将给中医药学在基因组学方面的研究带来了极大的机遇，中医药学的发展有望从功能基因组学方面的研究取得突破性的进展。中医药学是我国具有民族文化特色的学科,擅长于从整体上进行功能的调节。已有不少报道中医药或针灸能对某些关键性功能基因进行调控,从而改善以至纠正病理状态,达到国际前沿水平。例如β-地中海贫血(β-地贫)是经典的遗传性疾病,虽然是单基因病,由于基因的多态性而有多种多样的类型,当前采用的基因治疗因同源重组尚未解决,离开临床应用尚有距离。吴志奎等根据中医“肾生髓”的理论,在广西高发区对29例β-地贫患者采用益髓生血灵治疗,并与西药马利兰的疗效进行比较,在不输血的情况下,益髓生血灵提高血红蛋白显著,疗效维持时间长,明显优于马利兰的临床效果。与此同时,对β-地贫患者中药治疗前后进行了大样本较系统的基因型分析,观察到不同基因突变型疗效有明显差异,从基因突变与疗效关系的研究中表明中药治疗并不改变患者的基因突变型,而是开启γ-基因,促进γ-珠蛋白基因表达,诱导血红蛋白Ｆ合成增加,从而代偿了β珠蛋白基因功能缺陷,达到治疗目的。其重要意义不仅显示中医通过调节机体功能治疗疑难病的优势,而且这是首次在国际上用药物对单基因遗传病实现不是改变基因的结构,而是修饰、调节基因表达与基因产物功能获得无副作用与后遗症的显著疗效。

2 基因表达谱的概念及研究进展

基因调控研究表明，人体每—细胞、每一组织，在不同的发育、分化阶段，不同的生理条件和病理状态下，其表达的基因种类以及每一基因的表达丰度都是各不相同的，且此差别存在严格调控的时空特异性。生命过程的精确机制很大程度上正是基于这类基因的精细调控，许多生命现象的深层次问题都集中于此。而结构基因组研究不能告诉人们哪些基因在何时何地以何种程度表达。

差不多在结构基因组研究开始的同时，以鉴定基因功能、阐释严格时空和细胞依赖性的基因表达调控机制为中心的功能基因组研究也紧锣密鼓的开始了。功能基因组研究的开始常以Adams等(1991)提出的“cDNA计划”(cDNA project)和表达性序列标志(expression sequence tag，EST)的概念为标志。cDNA是与基因转录物信使RNA互补的DNA，代表了基因的生物学信息。EST指长度为300~500bp的部分cDNA，其对人类基因转录图的制作、全长基因的克隆、基因表达谱的研究等有重要作用。“cDNA计划”的主要目标是，收集大量的cDNA序列片段，并将之通过数据库同源性检索以鉴定新基因。由于这些cDNA序列片段是基因全长转录物的一个片段，除非这一片段正好对应了某一基因家族的保守区，它往往代表着—个基因，因此Adams MD等称这些cDNA序列片段为EST。目前，从EST出发鉴定新基因的策略已逐步得到完善。但由于“cDNA计划”当初是为鉴定新基因而设计，鉴于文库组成的“偏性”(bias)，由该方法收集到的EST并不能作为特定细胞或组织表达基因的量化分析的数据来源。

在此背景下,Okubo等(1991)提出了勾画人体基因图(body map of expressed human genes)的宏伟设想,并界定了基因表达谱(gene expression profile)的概念。通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的非偏性cDNA文库,大规模cDNA测序,收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群体组成,从而描绘该特定细胞或组织在特定状态下的基因表达种类和丰度信息,这样编制成的数据表就称为基因表达谱。该谱实际上从mRNA水平反映了细胞或组织特异性表型和表达模式。如果收集各类组织和细胞的基因表达谱,将每一个表达的基因标记到其表达的组织,就能组成一张人体基因图;抑或对这些各不相同的基因表达谱作两两或多重比较,就能筛选出细胞特异性或发育阶段特异性的基因,这项工作无疑将对阐释基因表达调控机制十分有益。由此,可以从一个新的视角系统、全面地深化人们对发育、分化、进化和衰老等基本生命现象,以及肿瘤、心血管疾病等危害人类健康的重大疾病发生机制的认识。

近年来,人们相继开展了一系列大规模基因表达检测技术,如大规模EST测序法(Okubo et at. 1991)、微阵列法(microarray) (Wodicka et al., 1997)、DNA芯片(Ramsay et al., 1998)及SAGE法(serial analysis of gene expression) (Velculescu at al., 1995)。这些方法都能定性、定量且大规模地检测基因的表达产物mRNA,并绘制基因表达谱。利用这些基因表达谱检测技术,已在以下几个方面开展了研究:

(1)正常细胞或组织基因表达谱研究,主要的细胞有角膜上皮细胞(Nishida et al., 1996)、角质化细胞(Kita et al., 1996)、外周血粒细胞(Itoh et al., 1998)，主要的组织有正常人垂体、肝脏发育相关基因群、人结肠粘膜组织,以及人和小鼠肝脏的基因表达谱比较研究。

(2)疾病相关基因表达研究：主要的有①肿瘤相关基因表达研究如神经母细胞瘤(neuro-blastoma, NB)细胞系(CHPl34) 、食管癌及癌旁组织、鼻咽癌、肺癌基因表达谱的研究；②炎症相关基因表达研究如类风湿关节炎、肠炎基因的特征性表达活性；③细胞病理相关基因表达研究如人T淋巴细胞在热休克条件下和佛波酯作用下的基因表达差异研究。

(3)染色体表达图谱绘制，如酵母基因组基因的SAGE分析法。

(4)基因功能研究，如RAS基因和p53基因功能的研究。

(5)药物作用机制的研究，如Gray等(1998)报道通过测定药物使用前后mRNA水平的变化,分析了激酶抑制剂对酵母大规模基因组的影响。而Marton等(1998)报道了免疫抑制药物FK506的基因表达模式特征,与此相同的模式在携带FK506靶基因无效突变的酵母细胞中也能观察到,从而确定了一种基因功能通过遗传和药理作用消除后可导致基因表达的类似变化。Clarke等(1999)用基因芯片研究了肠癌患者化疗前和治疗期间肿瘤基因表达情况,发现丝裂霉素-C和5-氟尿嘧啶治疗均可使糖苷合成酶和尿嘧啶-DNA糖基酶的基因表达增加。这类研究有助于阐明药物的作用机制和确定药物作用的靶基因,为新药研究提供线索。

(6)毒理学研究，如Nuwaysir等(1999)研制了包括涉及细胞凋亡、DNA复制和修复、氧化应激/氧化还原内稳态、过氧化物酶体增殖反应、二噁英/多环芳烃反应、雌激素反应、看家基因、癌基因和抑癌基因、细胞周期控制、转录因子、激酶、磷酸酶、热休克蛋白、受体、细胞色素P450等共2090个基因的毒理芯片(ToxChipv1.0),该芯片既可用于毒物的检测和遗传多态性的检测,又可用于受检毒物的毒作用机制的研究。最近,Holden等从人和小鼠文库中选择约600个与毒理学相关基因的cDNA克隆,制备了种属特异的毒理基因组学芯片,可研究肝脏毒性、内分泌干扰、致癌作用等毒性终点的作用机制,也可用于确定以基因表达模式为基础的化合物的毒性。

3 基因表达谱在中医药研究中的运用

3.1 辨证分型和诊断

目前认为所有疾病均存在基因表达的变化。有人估计与癌症相关的原癌基因约有1000个,抑癌基因约有100个。约有6000种以上的人类疾患与各种人类基因的变化相关联。近几年来国际上已出现了若干与疾病相关的数据库。现代医学正在通过功能基因组学研究,着手编制各种疾病的基因表达谱,从基因检验方面进行诊断。例如周津等研究了食管癌及癌旁组织的基因表达谱，首次为食管癌细胞的恶性表型提供了分子遗传学参考数据,一些与肿瘤发生相关的差异表达基因为发展生物标记物或肿瘤早期诊断和治疗提供了线索。Heller等采用基因表达芯片研究了类风湿关节炎、肠炎基因的特征性表达活性。通过该研究,确定了许多基因与这两种病变的关系,为治疗和发病机制的研究提供了新的思路。

中医药学能够历经几千年而不衰,其主要的精华在于辨证论治,注重个体化治疗。历代医家在几千年的医疗实践中积累了极为丰富的临床经验,中医药疗法在很多疾病的治疗中表现了确切的疗效。但中医在辩证论治过程中存在着证候概念命名和证候辨证标准的不统一，缺乏客观的实验室量化指标，更难以从微观量化指标来评价，阻碍了中医理论的发展及中医药现代化和国际化的进程。随着人类基因组计划的深入,尤其是功能基因组学研究技术的不断发展,从基因组微观分子水平研究中医基础理论——辨证分型的时机已经成熟。其根据在于基因科学技术的发展:一是已经构建与疾病相关的人类基因信息数据库和分析软件,迄今,国际上有3个大的生物信息中心,即美国的国家生物技术信息中心(NCBI, http://www.ncbi.nlm. nih.gov)、欧洲分子生物学实验室(EMBL, http://www.ebi.ac.uk)和日本DNA数据库(DDBJ, http://www.ddbj.nig.ac.jp)，已经建立和维持了源自数百种生物的cDNA和基因组DNA序列的大型数据库。这些中心和全球的基因组研究实验室通过网点、电子邮件或者直接与服务器和数据库联系而获得的搜寻系统,使得研究者可以在多种不同的分析系统中对序列数据提出质询。二是已经发展快速、有效的对患者血液、体液、组织等样品进行测序和序列信息检测的技术，如大规模EST测序、SAGE和基因芯片技术在基因表达谱研究中的运用。祖国医学认为“正气存内,邪不可干;邪之所凑,其气必虚”。中医学非常重视机体内部正气——基因组正常表达功能的作用。随着基因科学技术的日臻成熟，微观辨证分型已经完全可以从基因表达谱的比较分析得以实现。

基因表达谱是从mRNA水平反映了细胞或组织特异性表型和表达模式，与临床上出现的症状和体征有着必然的内在联系。那么，运用大规模、高通量的基因表达检测技术，对大量的同一证型疾病状态下的各类组织和细胞的mRNA进行定量分析,编制基因表达谱,经过生物信息学和统计学的比较分析,就可以建立疾病证型特定的基因表达谱数据库。设想证型基因表达谱数据库可由与脏腑、阴阳、气血、寒热、虚实相关的特定基因表达谱子数据库组成。编制患者的基因表达谱，与数据库中的已建立的证型特异基因表达谱进行生物信息学比较分析，就可以做出辨证分型诊断。这方面的研究工作目前尚未见报道。但开展这项工作研究的尝试对于中医基础理论的阐释是十分有益的，可以从一个新的视角系统、全面地深化人们对中医气血、阴阳、寒热、虚实等生理病理规律的认识。因此，尽快开展疾病证型基因表达谱的构建研究，不仅促进中医药理论的发展，而且对临床实践和中药开发起着指导和促进作用。

3.2 中药作用机理及其开发

3.2.1 中药作用机理的研究

中药作用特点在于作用的多效性、量效关系的复杂性、作用的相对不稳定性、某些中药的双向调节作用等。同时中药作用方式上又具有多成份、多环节、多靶点的特性。这些复杂的特点，以往的药物研究方法，很难从整体到细胞水平，甚至是蛋白质水平进行全面地研究。现代药理学分子水平的研究已明确药物作用都有其“靶基因”。靶基因也是中药作用的最本质的指标。中药作用靶基因研究的主要策略包括选择药物起效、活化、排泄等过程相关的候选基因进行研究,鉴定基因序列的变异。这些变异既可以在生化水平进行研究,估计它们在药物作用中的意义,也可以在人群中进行研究,用统计学原理分析基因突变与中药药效的关系。基因技术的发展已经给鉴定遗传变异对药物作用的影响提供了前提条件。已经有研究开始鉴定一些普通的基因变异,这些基因是药物作用的靶子,或者一些与控制药物作用、分布、排泄相关的基因。这些研究成果将有助于预测病人药物治疗的有效性与安全性,也可能成为医生在医疗实践中一种常规检查手段,决定哪种药物对某个病人最有效、最安全,可以避免潜在的药物毒副作用,病人可以更快地得到有效的治疗药物处方,治疗将更有效、更经济。

随着功能基因组学研究发展,现已出现了能够大规模对基因转录表达产物进行检测的技术，绘制基因表达谱,鉴定新基因。通过比较分析中药作用前后组织、细胞的基因表达谱,不但可以了解哪些基因在中药作用后表达了，哪些表达停止了，以及哪些表达升高，哪些表达下降，使得我们在分子水平了解中药的作用靶点及方式、代谢途径；而且还可以在基因表达水平上严格有效地控制中药制剂的质量标准。

长期以来我国中药复方的作用机理不明确、中药的安全性、质量标准化问题等尚未解决；中药的研究整体水平不高，一般的药物科研技术难于在中药新药的开发上有所突破。以至于我国的中药制剂鲜有进入国际市场，究其原因是国内中成药的质量检测标准与国际药品标准差距太大，中成药制剂成份复杂、生化指标不明确，重现性差。因此，只有将传统中医药的优势与现代先进的基因科学研究技术有效地结合，从基因表达水平研究阐明中药的作用机理、用药安全性，实行质量标准化，中药制剂才能拓展国内市场、走向国际市场。

目前，已有大型国际制药公司和科研机构从基因水平进行新药的超高通量筛选和对药理遗传学、药理基因组学等方面的研究。如基因芯片刚一问世，默克、史克必成和霍夫曼-拉罗歇等一流的制药公司分别与Synteni公司签订了20多项利用基因芯片研究药物的协议；葛兰素制药公司与基因芯片行业的领头羊-Affymetrix公司联合，将基因芯片技术用于高通量药物筛选方面的研究；美国礼莱（Eli Lilly）公司与Millennium公司合作，用基因芯片技术共同进行治疗充血性心力衰竭药物作用靶点方面的研究；拜耳公司与Millennium公司合作，通过基因芯片技术研究疾病的基因表达情况，从而探寻药物作用的靶点；

3.2.2 中药有效成份的筛选

传统的分析方法在中药有效成分筛选方面速度很慢,对成分复杂的中药复方,几乎无能为力,而大规模的基因表达谱检测技术将发挥其快速、高通量独特的优势。一般中药疗效慢除与有效成分含量低有关外,其中一个原因就是中药主要通过调节机体的整体机能,即通过对基因的表达调控而起作用。据此,我们通过绘制基因表达谱分析用药前后整个机体的不同组织、器官基因表达差异,不但可以从众多的药物成份中筛选到起作用的部分物质，还可以了解到药物成份配伍作用特点。

现代药物筛选中,对药物筛选影响更直接的是药物作用新靶的发现,而这些新靶一般是由新发现的基因编码的,因而目前大部分公司和科研机构进行以基因为基础的药物研究过程是:基因组-新靶点筛选-先导物-药物,即基因-受体-药物。而基因表达谱的比较研究能够迅速筛选药物作用新靶点，不仅可以筛选和鉴定药物作用靶基因，而且还可以了解一些与控制药物作用、分布、排泄相关的基因。药物不同成份能够影响不同的基因表达，因此基因表达谱研究在药物成份的筛选上有着巨大的优势，通过分析比较中药作用前后的基因表达谱可迅速找到中药的有效成份。据报道，香港科技大学生物技术研究所利用基因芯片技术已筛选到知母的23种有效成份。

3.2.3 有效的中药复方、单方的筛选

随着高科技的发展和社会的进步，人口老化日趋严重和一些新疑难杂病的出现，使人们对单一成份合成药物防止疾病失去信心，因而回归自然的呼声日渐高涨，发展中药已成为当今世界的一大趋势，中药也许在某一单一的作用方式上不如西药强，但在中医药理论指导下运用的中药复方，对人体的多方面调节作用及较小的毒副作用是任何一种西药乃至西药复方所达不到的。用某些中药复方或中药中提取的有效成份替代副作用较强的西药，已成为新的开发热点。一些发达国家的大药厂已着手进行开发，如日本、韩国的“汉方制药”已经兴起，并已垄断了国际市场。中医药是我国的瑰宝,几千年的历史,积累了大量的临床经验,在选择哪些药物相配,开发什么样的复方上,我们应该比国外同行更有优势。中药复方成份虽然复杂,但如果借助现代的基因表达谱检测技术就能更快速、更准确、更为可行地进行中药君、臣、佐、使的配伍和成份研究。同时，利用基因表达谱检测技术可以将传统的古方、验方、秘方在基因转录表达水平进行准确、快速、高效的筛选或验证,大大缩短新药研究的周期。

3.2.4 用于中药的安全性（毒性）评价

中药的安全性一直是最近几年来国内外关注并探讨的问题。早在1978年新加坡卫生部发布公告，宣布黄连及其所含小檗碱为毒物并禁用，以防止新生儿黄疸；据日本1990-1993年的有关资料报道35例中药引起的药物性肺炎，其中28例为小柴胡汤所致（其中以黄芩最敏感），少数为柴苓汤、柴朴汤所致；同时，1992年比利时发现服用含有广防已和厚朴的减肥中药可引起肾衰，而其中马兜铃科植物广防已（含有汉防已甲素、马兜铃酸）和汉防已两种药材的混用则是导致马兜铃酸致肾衰的主因，因而停止进口此类减肥中药；近年来国内南京军区总院肾病专家黎磊石教授又提出“中药肾”的概念，所谓“中药肾”，是指服用某些中药可导致肾功能衰竭。越来越多的事实说明：中药的毒性、安全性检测将成为中药研究的又一热点。如何准确、快速、高效地评价中药复方及其组成药物是否有毒？如何确定有毒中药、中药的有毒成份、中药的有毒部位？基因表达谱检测技术在中药领域的运用将为我们提供有效的手段。如果用基因表达谱分析研究某种中药或其提取物作用于细胞后基因表达mRNA的变化，如发现一些重要的功能基因表达有明显改变，则提示此物质在研究剂量下可能有一定的毒性。有关毒理学方面的基因芯片的研究已有不少报道,近来，NIEHS研究小组研制了一种名为TOXCHIP的装置，其实质是通过检测化合物作用于细胞后基因的改变来研究其毒性。它所涉及到的基因包括凋亡、细胞周期调控、药物转化代谢、DNA复制与修复等。可达到省时、省力，且可减轻对实验动物的依赖。

摘自[科技之光]